SDS-PAGE蛋白凝胶电泳PPT参考幻灯片
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第四章 SDS聚丙稀酰胺凝胶电泳 ppt课件
②咪唑缓冲系统的样品缓冲液（0.01mol/L，PH7.0）：
ppt课件
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浓缩胶缓冲液贮液（mL） 2.4
分离胶缓冲液贮液（mL） ---10％ SDS 双蒸水（mL） 10％过硫酸铵（uL） 0.2 14 10
---7.5 0.3 17.2 10
---7.5 0.3 12.2 10
---7.5 0.3 7.2 10
--7.5 0.3 2.2 10
TEMED （uL）
10
TEMED （uL）
10
10
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10
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水平式电泳装置
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2.样品的准备
⑴ 样品缓冲液的配置
根据SDS电泳的原理，样品缓冲液中必须含有3-4倍于 蛋白的SDS和足以断裂二硫键的还原剂（2％-3％二硫 苏糖醇或4％-5％β -巯基乙醇）。由于巯基乙醇具有 强挥发性，最好在配置样品前将其加到样品缓冲液中。 配置好的样品还必须在100℃中水浴保持3-5mins。通常 在样品溶液中加1％到2％（W/V）SDS，在凝胶中加0.1 ％ SDS。
⑷ 10％过硫酸铵（AP）
0.1g过硫酸铵＋1.0ml双蒸水。使用前新鲜配置。
ppt课件
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SDS连续电泳用的配方
贮液
T=5.1％ 单体贮液（mL） 凝胶浓度(c=2.6％) T=7.7％ T=10.2％
5.3 10.0 4.5
6.7 10.0
9.0 10.0
缓冲液贮液（mL）
双蒸水（mL） 10％过硫酸铵（uL） TEMED （uL）
19.5g NaH2PO4.2H2O+129.0g Na2HPO4.12H2O+5g SDS, 再用双蒸水溶解到2.5L,检查PH. 17.0g 咪唑+5g SDS+1.5L双蒸水，用稀磷酸调至PH7.用 双蒸水稀释至2.5L，再检查PH.
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子质量PPT课件
在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的分子大小和形状 以及所带电荷多少等因素所造成的电泳迁移率有差别。在 聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠 （SDS），形成蛋白质－SDS复合物，这种复合物由于结 合了大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态，形成 了仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或 消除了各种蛋白质分子之间的天然的电荷差异，此时，蛋 白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其 它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。
四、浓缩胶的配制（5%）
试剂
H2O 凝胶贮备液 分离胶缓冲液(pH6.8) 10% SDS
TEMED 10%过硫酸铵
总体积
体积 2.92（ml） 0.8（ml） 1.25（ml） 0.05（ml）
5（ul） 25（ul） 5.05（ml）
五、浓缩胶的灌注和聚合
用移液管将所配制的浓缩胶缓冲液沿 着凝胶腔的长玻璃板的内面缓缓注入，将 梳子插入胶液顶部，放置室温下待其聚合。
• 必须学会欣然面对的一种结果----被接纳
• 以具体的形式感谢招聘单位的接纳，如邮件、短信 • 考虑怎样使自己的知识能力更适应工作需要 • 把走进工作岗位当作职业生涯的重要的第一步，认
真思考如何为以后的发展开好头。
结束语
当你尽了自己的最大努力时，失败也是伟大的， 所以不要放弃，坚持就是正确的。
When You Do Your Best, Failure Is Great, So Don'T Give Up, Stick To The End
相对迁移率mR=蛋溴白酚质蓝样区品带距中分心离距胶分顶离端 胶迁 顶移 端距 距离 离((ccmm))
以标准蛋白质分子量的对数对相对迁移 率作图，得到标准曲线，根据待测样品相对 迁移率，从标准曲线上计算出其分子量。
SDS-PAGE-聚丙烯酰胺凝胶电泳详解ppt课件
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2
SDS的作用
破坏蛋白质分子之间以及其他物质分 子之间的非共价键，使蛋白质变性而改变 原有的构象，保证蛋白质分子与SDS充分结 合而形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。
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3
二、SDS-PAGE的基本原理
（一）蛋白质分子的解聚 样品介质和聚丙烯酰胺中加入离子
去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的 电泳迁移率主要取决于亚基分子量的 大小，而电荷因素可以被忽略。
连续电泳 不连续电泳
（3）根据电泳的形式
圆盘电泳 垂直电泳
平板电泳 水平电泳
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2、操作 （1） 制备分离胶 （2） 制备积层胶(堆积胶）
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下的反应： 蛋白质本身的电荷被屏蔽 氢键断裂 疏水相互作用被取消 多肽被去折叠(二级结构破坏),并形成椭球形
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①还原SDS处理 当加入还原试剂DTT或β-二巯基乙醇后，
蛋白质被完全去折叠，只根据分子量分离。
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②带有烷基化作用的还原SDS处理 烷基化作用可以很好地并经久牢固地保护
（3）长轴的长度则与亚基分子量的大 小成正比。
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胶束在SDS-PAGE系统中的电泳迁 移率不再受蛋白质原有电荷的影响，
而主要取决于椭圆棒的长轴长度，即 蛋白质或亚基分子量的大小。
当蛋白质的分子量在15KD— 200KD之间时，电泳迁移率与分子量 的对数呈线性关系
SDS-PAGE 原理 步骤 详细介绍 含图片ppt课件
当蛋白质的分子量在15KD— 200KD之间时，电泳迁移率与分子量 的对数呈线性关系
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10
3、影响SDS电泳的关键因素 （1） 溶液中SDS单体浓度 大多数蛋白质与SDS结合的重量比 为1：1.4 （2） 样品缓冲液的离子强度 低离子强度的溶液中，SDS单体才 具有较高的平衡浓度
.
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（3） 二硫键是否完全被还原 当二硫键被彻底还原后，蛋白质分
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（2）根据缓冲系统和凝胶孔径的不同
连续电泳 不连续电泳
（3）根据电泳的形式
圆盘电泳 垂直电泳
平板电泳 水平电泳
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2、操作 （1） 制备分离胶 （2） 制备积层胶(堆积胶）
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分离胶聚合之后
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不同分子量范围的蛋白质应选用不 同的凝胶浓度
.
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（四）分子量测定 1、相对迁移率（Rf） Rf即用每个带的迁移距离除以溴酚蓝 前沿的迁移距离得到的。 测量位置应在蛋白带的中央。
蛋白带迁移距离 Rf= ————————
溴酚蓝迁移距离
.
20
蛋白带迁移距离 固定前的凝胶长度
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS-PAGE
.
1
一、什么是SDS
十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate,SDS) 是一种阴离子去污剂。它在水溶液中以单体 （monomer）和分子团（micellae）的混合形 式存在
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3、影响SDS电泳的关键因素 （1） 溶液中SDS单体浓度 大多数蛋白质与SDS结合的重量比 为1：1.4 （2） 样品缓冲液的离子强度 低离子强度的溶液中，SDS单体才 具有较高的平衡浓度
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（3） 二硫键是否完全被还原 当二硫键被彻底还原后，蛋白质分
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（2）根据缓冲系统和凝胶孔径的不同
连续电泳 不连续电泳
（3）根据电泳的形式
圆盘电泳 垂直电泳
平板电泳 水平电泳
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2、操作 （1） 制备分离胶 （2） 制备积层胶(堆积胶）
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分离胶聚合之后
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不同分子量范围的蛋白质应选用不 同的凝胶浓度
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（四）分子量测定 1、相对迁移率（Rf） Rf即用每个带的迁移距离除以溴酚蓝 前沿的迁移距离得到的。 测量位置应在蛋白带的中央。
蛋白带迁移距离 Rf= ————————
溴酚蓝迁移距离
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蛋白带迁移距离 固定前的凝胶长度
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS-PAGE
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1
一、什么是SDS
十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate,SDS) 是一种阴离子去污剂。它在水溶液中以单体 （monomer）和分子团（micellae）的混合形 式存在
《sdspage凝胶电泳》课件
生物标志物发现
通过SDS-PAGE凝胶电泳结合质谱分析等技术，可以发现新的生物 标志物，用于疾病诊断、药物研发和生物医学研究等领域。
药物筛选
SDS-PAGE凝胶电泳可用于药物筛选过程中的目标蛋白分离和纯化， 提高筛选效率和成功率。
在蛋白质组学研究中的应用前景
蛋白质表达分析
SDS-PAGE凝胶电泳可以用于分析不同细胞或组织中蛋白 质的表达情况，有助于研究疾病发生发展过程中蛋白质表 达的改变。
对样品处理要求高
为了获得理想的分离效果，需要对蛋白质样品进行充分处理，如加入 变性剂、还原剂等，这可能会影响样品的天然构象和功能。
05
CATALOGUE
SDS-PAGE凝胶电泳的发展前景
在生物科学研究中的应用前景
蛋白质组学研究
SDS-PAGE凝胶电泳是蛋白质组学研究中常用的分离技术之一，可 用于分离和鉴定蛋白质，为研究蛋白质结构和功能提供基础数据。
缺点
样品损失
在SDS-PAGE凝胶电泳过程中，样品中的蛋白质可能会吸附到凝胶或 电极上，导致一定程度的损失。
无法分离大分子量蛋白质
对于分子量大于凝胶孔径的蛋白质，SDS-PAGE凝胶电泳无法进行有 效分离。
无法分离带电荷差异小的蛋白质
SDS-PAGE凝胶电泳主要依据蛋白质的分子量和电荷差异进行分离， 对于带电荷差异较小的蛋白质，分离效果可能不佳。
03
CATALOGUE
SDS-PAGE凝胶电泳结果分析
蛋白质条带的观察与识别
蛋白质条带观察
通过染色或荧光染色，观察凝胶 电泳后的蛋白质条带，判断蛋白 质是否成功分离。
蛋白质识别
根据蛋白质条带的颜色、亮度、 形状等特征，识别并标记不同的 蛋白质条带。
通过SDS-PAGE凝胶电泳结合质谱分析等技术，可以发现新的生物 标志物，用于疾病诊断、药物研发和生物医学研究等领域。
药物筛选
SDS-PAGE凝胶电泳可用于药物筛选过程中的目标蛋白分离和纯化， 提高筛选效率和成功率。
在蛋白质组学研究中的应用前景
蛋白质表达分析
SDS-PAGE凝胶电泳可以用于分析不同细胞或组织中蛋白 质的表达情况，有助于研究疾病发生发展过程中蛋白质表 达的改变。
对样品处理要求高
为了获得理想的分离效果，需要对蛋白质样品进行充分处理，如加入 变性剂、还原剂等，这可能会影响样品的天然构象和功能。
05
CATALOGUE
SDS-PAGE凝胶电泳的发展前景
在生物科学研究中的应用前景
蛋白质组学研究
SDS-PAGE凝胶电泳是蛋白质组学研究中常用的分离技术之一，可 用于分离和鉴定蛋白质，为研究蛋白质结构和功能提供基础数据。
缺点
样品损失
在SDS-PAGE凝胶电泳过程中，样品中的蛋白质可能会吸附到凝胶或 电极上，导致一定程度的损失。
无法分离大分子量蛋白质
对于分子量大于凝胶孔径的蛋白质，SDS-PAGE凝胶电泳无法进行有 效分离。
无法分离带电荷差异小的蛋白质
SDS-PAGE凝胶电泳主要依据蛋白质的分子量和电荷差异进行分离， 对于带电荷差异较小的蛋白质，分离效果可能不佳。
03
CATALOGUE
SDS-PAGE凝胶电泳结果分析
蛋白质条带的观察与识别
蛋白质条带观察
通过染色或荧光染色，观察凝胶 电泳后的蛋白质条带，判断蛋白 质是否成功分离。
蛋白质识别
根据蛋白质条带的颜色、亮度、 形状等特征，识别并标记不同的 蛋白质条带。
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蛋白质是29：1 核酸是19：1
( H2C CH)n
CO
NH2
H2C CH ( H2C CH)n H2C CH ( H2C CH)n
CO
CO
CO
CO
HN
NH2
HN
NH2
CH2
CH2
NH
NH
CO
H2C CH ( H2C CH)n
CO
CO H2C CH
NH2
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实验原理
1、带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移 动，这种现象称为电泳。
加样缓冲液
巯基乙醇
断二硫键
SDS
断化学键
H3C
SO4Na 带负电荷
SDS：Pr=1.4:1
甘油
促沉
二硫键 盐键 疏水作用 氢键
溴酚兰
? Tris
19
实验原理
• 浓缩效应
pH6.8
Pr-
Gly- Gly-
Cl- Cl- Cl-
Pr-
Gly- Gly-
Cl- Cl- Cl-
Pr-
Gly- Gly-
Cl- Cl-Cl-
主要离子
氯离子 甘氨酸离子(pI5.97) 蛋白质离子
pH8.8
快慢离子的产生 高的电压梯度 Pr-运动加速
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实验原理
• 浓缩效应
pH6.8
5%
Gly- Gly-
Gly- Gly- Gly- Gly-
主要离子
氯离子 甘氨酸离子 (pI 5.97) 蛋白质离子
pH8.8
10%
Cl- Cl- Cl- Cl- Cl- Cl- Cl- Cl-Cl-
主要离子
氯离子 甘氨酸离子(pI5.97) 蛋白质离子
甘氨酸解离增加 无快慢离子 Pr-根据分子量运动 分子筛效应
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实验原理
• 分子筛效应
lgMw lgMw=-bx+K
pH6.8
5%
pH8.8
10%
电泳迁移率
Pr Mw在11.7-165Kd
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实验原理
蛋白质移动的距离
迁移率= 脱色后的胶长
染色前胶长 指示剂移动的距离
H2O 30%Acr-Bis
3.9ml 3.3ml
3.4ml 0.83ml
Buffer (含SDS) 10%APS
(1.5M Tris-Cl pH8.8) (1M Tris-Cl pH6.8)
2.6ml
0.68ml
200ml
100ml
TEMED
10ml
10ml
TOTAL
10ml
5ml
5
❖制备分离胶(下胶)
28
Marker 97 66
44
29
20 14
31
Tanon-1600数码凝胶图像分析系统
GIS 1D 图像分析软件(Ver. 4.00)
通电
加入电极缓冲 液pH 8.3
加入样品
浓缩胶 pH 6.8
开始电压恒定在80V，当进入分离胶后改为120V，溴酚 蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。
分离胶 pH 8.8
11
Staking gel Separating gel
12
电流路径
负极 凝胶
正极
外槽
——
内槽
——
外槽
13
实验过程
5. 染色、脱色 A. 染色20分钟
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）
1
实验流程
配胶
配分离胶(下胶) 配浓缩胶(上胶)
样品制备
电泳（1.5~2h）
染色（20min）
脱色（30min~2h）
分析
3
实验过程
1.装配装置
BG-verMINI型迷你垂直电泳槽 (北京百晶)
4
实验过程
2.凝胶配制
*Acr有神经毒 性
下胶(分离胶)10% 上胶(浓缩胶)5%
氯离子 甘氨酸离子(pI5.97) 蛋白质离子
甘氨酸解离增加 无快慢离子 Pr-根据分子量运动 分子筛效应
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实验原理
• 分子筛效应
pH6.8
5%
pH8.8
10%
Gly- Gly-Gly- Gly-Gly-Gly- Gly-Gly-GlyCl- Cl- Cl- Cl- Cl- Cl- Cl- Cl-Cl-
快慢离子的产生 高的电压梯度 Pr-运动加速 浓缩效应
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实验原理
• 分子筛效应
pH6.8
5%
pH8.8
10%
Gly- Gly-
Gly-Gly-
Gly-Gly-
CGl-y- CGl-y-CGl-y- CGl-y-CGl-y-CGll-y- CGl-lyC-Gl-lCyl-G- ly-
主要离子
pH6.8
5%
pH8.8
10%
• 分子筛效应
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染色前
实验原理
迁移率= “蛋白质移动的距离”
指示剂移动的距离
L1 X L3
L2 X L4
染色后
Lx
蛋白质的带在哪呢？
L1
L4
L3
L2
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PageRuler Prestained Protein Ladder A prestained SDS-PAGE MW marker with contrasting colored reference bands at 10 and 70kDa.
H2C CH H2C CH H2C CH
*Acr有神经毒 性
H2C CH H2C CH
CO
CO
CO
CO
CO
CO H2C CH
H2C CH CO
HN CH2 NH
NH2
NH2
NH2
NH2
HN
CH2
NH
CO H2C CH
n决定了交联度
CO
H2C CH
( H2C CH)n
CO
NH2
与浓度一起决定孔径的大小
电荷 分子大小 分子形状
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实验原理
• 浓缩效应
PH6.8
Pr-
Pr-
Pr-
Cl-
Cl- Gly- Cl-
Cl-
Cl-
Cl-Gly- Gly-
GlyCl- Gly- Cl- Gly-
Gly-
Cl-
主要离子
氯离子 甘氨酸离子(pI5.97) 蛋白质离子
PH8.8
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Pr为什么带负电
C N
氨基酸侧链
封水或饱和 正丁醇溶液
出现明显界面时， 分离胶凝聚完成 （ 10~20min）
倒出水或正丁醇， 并用加样枪/滤纸 吸干
加入分离胶溶 液 pH 8.8
✓ 封水的目的是使分离胶上表面平直，并排除气泡。 ✓ 凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。
7
❖制备浓缩胶(浓缩胶)
插入样品梳
加入浓缩胶溶 液 pH 6.8
样梳需一次平稳插入,梳 口处不得有气泡,梳底需 水平。
分离胶 pH 8.8
8
样品处理
Sample buffer
1. SDS
2. - mercaptoethSanaoml ple buffer
3. bromophenol blue
4. Glycerol
金属浴(100℃)中15min
SH
SH
s s
9
❖上样及电泳
考马斯亮兰R250
B. 脱色30分钟至2小时
14
蛋白质的染色方法
• 氨基黑
血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳
• 考马斯亮兰R-250，G250
G250测定蛋白含量
• 银染
敏感度最高，常应用于蛋白质双向电泳
15
H2C CH CO NH2
H2C CH CO
HN
+
CH2 NH
聚合原理
过硫酸铵是催化剂
TEMED是加速剂