层析包括吸附层析分配层析离子交换层析亲和层析等演示文稿
层析的概念和分类
层析的概念和分类
层析（chromatography）是一种利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术，用于分离混合物中的各个组分。
层析系统由两个相组成：固定相和流动相。
当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组分的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量比）不同。
随流动相向前移动，各组分不断地在两相中进行再分配。
分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组分，从而达到将各组分分离的目的。
根据不同的分类标准，层析可以分为多种类型：
1. 根据固定相的形式，层析可以分为柱层析和平板层析。
柱层析是待分离物质在柱状固定相中进行的层析分离技术，而平板层析则是在平板型固定相中进行的分离技术。
2. 根据流动相的组成，层析可以分为有机层析和无机层析。
有机层析是利用有机溶剂作为流动相的层析技术，而无机层析则是利用无机溶剂或无机盐溶液作为流动相的层析技术。
3. 根据分离原理，层析可以分为吸附层析、分配层析、凝胶过滤层析、离子交换层析和亲和层析等。
以上信息仅供参考，如有需要，建议查阅化学书籍或咨询化学专家。
层析包括吸附层析分配层析离子交换层析亲和层析等讲课文档
质也可利用吸附柱层析分离。
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2、层析法是目前广泛应用的一种分离技术，是分离 各种生物大分子的主要手段之一，是利用不同物
质理化性质的差异而建立起来的技术。
3、40年代：两位英国科学家Martin和Synge发明 了分配色谱（层析），他们首先提出了色谱塔板理论， 获得了1952年的诺贝尔化学奖。由此，层析技术成为
凝胶和生物胶P，强酸强碱能引起结构破坏。最好使 用条件控制在pH 4～9之间，温度0～40℃。
第三十页，共117页。
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• 对样品的吸附作用很小
• 琼脂糖凝胶的机械强度和孔穴的稳定性都很好，
• 在高盐浓度下，柱床体积一般不会发生明显变化，使用琼脂糖 凝胶时洗脱速度可以比较快
• 排阻极限很大，分离范围很广，适合于分离大分子物质， 但分辨率较低
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层析系统都由两个相组成：一是固定相，它或者是固体物 质或者是固定于固体物质上的成分；另一是流动相，即可 以流动的物质，当待分离的混合物通过固定相时，由于各 组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、 溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比） 不同，与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移动时 受到的阻滞作用小，向前移动的速度快。反之，与固定相 相互作用越强的组份，向前移动速度越慢。分部收集流出 液，可得到样品中所含的各单一组份，从而达到将各组份 分离的目的。
操作容量：在特定条件下，某种成分与基质反应达到 平衡时，存在于基质上的饱和容量。每克（或毫升） 基质结合某种成分的毫摩尔数（或毫克数）。
数值大，结合力强。
膨胀度（Vβ)： 在一定溶液中，单位重量的基质充分溶胀后所
第六章 层析技术
常用术语
固定相：是由层析基质组成的，其基质包括固体
物质（如吸附剂、离子交换剂）和液体物质（如固 定在纤维素或硅胶上的溶液），这些物质能与相关 的化合物进行可逆的吸附、溶解和交换作用。
流动相：在层析过程中推动固定相上的物质向 一定方向移动的液体或气体称为流动相。在柱层 析时，流动相又称洗脱液或洗涤剂。在薄层层析 时流动相又称展层剂。
几个概念
吸附剂 吸附剂的选择主要依据吸附剂本身和被吸附物
质的极性，为活性多孔固体，表面积大、颗粒均 匀、吸附选择性好、稳定性强和成本低廉等性能。
常用的吸附剂有活性炭、硅石、氧化铝、羟基 磷灰石等。
• 羟基磷灰石（HA）[Ca10(PO4)6.(OH)2]
表面有Ca2+和PO43-两种带电基团。酸性和中性蛋 白质可与Ca2+结合，碱性蛋白质可与PO43-结合。
*气体作为流动相
*吸附在固体上的液体为固定相
按两相所处的状态分为： 液相色谱 液-固层析 液-液层析 气相色谱 气-固层析 气-液层析
（2）按层析原理分类
吸附层析 分配层析 离子交换层析 凝胶排阻层析
（3）按操作形式不同分类：
柱层析
纸层析
薄层层析
Liquid Chromatography
突出贡献: 预测气相色谱(1952年应用);提出用细小颗粒 作填料,而两端可以加压(HPLC).
1952年：马丁，辛格对分配层析的研究和发现， 诺贝尔化学奖
1952年，马丁同詹姆斯(James)一起，把分配层析应 用在分离气体上。各种气体或蒸汽的混合物可以利用氮 或氦一类情性载气的气流通过吸收性固体的表面。混合 的气体通过后，在另一端实现分离。
洗脱体积（Ve）：
是指某一成分从柱顶部到底部的洗脱液中出现浓度 达到最大值时的流动相体积。
03第三章_层析.ppt.Convertor
第三章层析概论一、层析以基质为固定相(柱状或薄层状)，以液体或气体为流动相，有效成分和杂质在这两个相中连续多次地进行分配、吸附或交换作用，最终结果是使混合物得到分离。
目前，这种方法已作为纯化或鉴定各种化合物的一种重要手段。
1903年俄国植物学家茨维特首先将碳酸钙细粉装入玻璃管内使其成柱形，然后把石油醚抽提的植物色素溶液倾入，让其通过碳酸钙柱，接着用石油醚洗涤发现，各种色层彼此可分开，柱上端呈黄色，较下端呈绿色，这就是早期的吸附层析碳酸钙细粉植物色素溶液石油醚洗涤二、层析类型层析方法可根据不同的标准分成若干类型：按流动相分类：液相层析和气相层析；按固定相“床”的形式分类：柱层析、薄板(层)层析、薄膜层析等等，详见表3~1。
三、层析常用术语1．固定相固定相是由层析基质组成的。
其基质包括：固体物质(如吸附剂、离子交换剂)液体物质(如固定在纤维素或硅胶上的溶液)，这些物质能与相关的化合物进行可逆性的吸附、溶解和交换作用。
2．流动相在层析过程中推动固定相上的物质向一定方向移动的液体或气体称为流动相。
在柱层析时，流动相又称洗脱剂或洗涤剂(即推动有效成分或杂质向一定方面移动的溶液)。
在薄层层析时，流动相又称展层剂。
3．操作容量即在特定条件下，某种成分与基质反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量；一般以每克(或毫升)基质结合某种成分的毫摩尔数或毫克数来表示。
(mmol/g, mg/g, mmol/ml, mg/ml)其数值大，表明基质对某种成分的结合力强；否则反之。
4．床体积(Vt)通常床体积是指膨胀后的基质在层析柱中所占有的体积(Vt)。
Vt是基质的外水体积(V0)和内水体积(Vi)以及自身体积(Vg)的总和，即:Vt = V0+ Vi + Vg(详见图3-1)5．外水体积(V0)外水体积指基质颗粒之间体积的总和。
6．内水体积(Vi)内水体积是指基质颗粒内部体积的总和。
7．基质体积(Vg)基质体积是指基质自身所具有的体积。
最新生物化学技术3吸附层析ppt课件
二、应用实例
1．用DNS—氨基酸的聚酰胺薄膜层析鉴定肽N末端
2．用DABTH—氨基酸的薄层法分析蛋白质序列
结束语
谢谢大家聆听！！！
43
化的
10．膨胀度 在一定溶液中，单位重量的基质充分溶胀后所占有的体积
（用Vβ表示）。即每克溶胀基质所具有的床体积 一般亲水性基质的膨胀度比疏水性的大
11．分配系数 是指一组分在固定相与流动相中含量的比值，常用K表示
12.迁移率 指一组分在相同时间内，在固定相移动的距离与流动相移
动距离之比值。常用Rf表示
第三节 聚酰胺薄膜层析
一、聚酰胺薄膜层析的概念
聚酰胺薄膜层析是1966年之后发展起来的一种层析方 法。特别应指出的是，用此法分析氨基酸衍生物DNP-氨 基酸、PTH-氨基酸、DNS-氨基酸以及DABTH-氨基酸1） 时，具有灵敏度高、分辨力强、展层迅速和操作简便等优 点，它超过了这类化合物过去使用的纸层析、纸电泳和薄 层层析(茚三酮法)等方法
➢吸附层析 的固定相
极性:如羟基磷灰石、硅胶、氧化铝、人造沸石等 非极性：如活性碳等
➢流动相通常为有机溶剂或缓冲液
一、常 用 术 语
1．固定相 固定相是由层析基质组成的。其基质包括固体物质(如吸
附剂、离子交换剂)和液体物质(如固定在纤维素或硅胶上的 溶液)，这些物质能与相关的化合物进行可逆性的吸附、溶 解和交换作用
加样操作示意图
（五）柱子再生
各种层析柱，其再生方法因固定相不同而异
六、实例应用
(1)纯化生命物质[72]： 天然的双链(ds)和热变性单链(ss)小牛胸腺DNA在HA层析柱 的分离图谱
(2)分离蛋白质的亚基[114] 14C-组氨酸标记的兔球蛋白亚基在HA层析柱的分离图谱
层析分离技术
4.2 吸附层析
吸附层析（Adsorption Chromatography ）是以吸附剂 为固定相，根据待分离物与吸附剂之间吸附力不同而 达到分离目的的一种层析技术。
按吸附剂和吸附物之间的作用力不同，吸附可分为三 种类型： 物理吸附：范德华力，吸附解吸速度快，选择性较差 化学吸附：生成化学键，达到平衡慢，选择性较好 交换吸附：极性分子或离子之间发生交换吸附…….
的活性物质提取分离，如维生素B12、四环素、土霉 素等，还可用于污水处理、糖浆脱色等。
大孔吸附树脂的选择和使用
选择依据： 吸附剂及吸附物的极性
一般来说，非极性吸附剂易从极性溶剂中吸附非极性 物质；极性吸附剂易从非极性溶剂中吸附极性物质； 中等极性的吸附剂对上述两种情况都具有吸附能力。 吸附物质的大小 吸附物分子较大的，应选择大孔树脂中孔径大的。
常用吸附剂按其化学结构可分两类
有机吸附剂，如：活性炭、纤维素、大孔吸附 树脂、聚酰胺等
无机吸附剂，如：硅胶、氧化铝、硅酸镁、硅 藻土、羟基磷灰石等
常用吸附剂简介
硅胶 是一种极性吸附剂，又是一种弱酸性阳离子交换
剂，其表面上的硅醇基能释放弱酸性的氢离子， 遇较强碱性化合物，则可因离子交换反应而吸附 碱性化合物； 应用于萜类、固醇、生物碱、酸性化合物、磷脂、 脂肪、氨基酸等的吸附分离。
HA的吸附机理
HA机理的主要观点是：HA的Ca2+和生物分子表 面的负电荷基团的结合，对生物分子的分离起重 要作用；而HA的磷酸基团与生物分子表面的正 电荷基团的结合，则起次要作用。
大孔吸附树脂
特点 大孔型颗粒，其孔隙、骨架结构和极性可按需要选
蛋白质化学中的层析技术PPT课件
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目
CONTENCT
录
• 层析技术简介 • 层析技术在蛋白质分离纯化中的应
用 • 层析技术原理 • 层析技术的应用实例 • 层析技术的优缺点及展望
01
层析技术简介
层析技术的定义
层析技术
是一种分离和纯化混合物中各组分的方法，基于各 组分在固定相和流动相之间的分配差异进行分离。
05
层析技术的优缺点及展望
层析技术的优点
分离效果好
层析技术能够根据分子间的吸附、分配等作用力 的差异，将混合物中的组分进行有效的分离，得 到高纯度的产物。
适用范围广
层析技术可以应用于不同性质的混合物分离，如 有机物、无机物、离子、蛋白质等，具有广泛的 适用范围。
分离过程可重复
层析技术是一种物理分离方法，不涉及化学反应 ，因此分离过程可以重复进行，适用于大规模分 离和制备。
凝胶过滤层析原理
原理概述
凝胶过滤层析是一种基于分子 大小差异的分离技术。通过不 同孔径的凝胶介质，不同大小 的分子会以不同的速度通过凝 胶，从而实现分离。
应用范围
凝胶过滤层析常用于蛋白质、 多糖等大分子物质的分离和纯 化。
技术特点
操作简便、分离效果好、分辨 率高。
离子交换层析原理
01 02
原理概述
1950年代
随着凝胶技术的发展，凝胶层 析、电泳等新型层析技术逐渐 兴起。
1970年代至今
层析技术不断改进和创新，应 用范围越来越广泛，成为生物 化学领域中重要的分离分析方 法。
层析技术的分类
根据固定相和流动相的物理状态
可分为液相层析和气相层析。液相层析又可分为液-固层析和液液层析，是生物分子分离纯化中最常用的技术。
层析法-理论ppt课件
方法：
(1) oligo(dT)-纤维素层 析柱法
(2) oligo(dT)-纤维素液 相结合离心法
(3)磁珠分离法
oligo(dT)-纤维素层析柱法
磁 珠 分 离 法
配体与载体结合
(固相化)
亲和层析
装柱
的基本过程
(亲和层析柱)
解吸附 洗柱
亲和吸附
(生物高分子与配体专一结合)
配体与载体的联接方法
固定相——滤纸上的吸附水 流动相——溶剂(乙醇、丙醇、丙酮及与水不相溶
的溶剂)
分离示意图
层 析 纸
层析缸
溶剂前沿
y x2
x1 起始线
(原点)
展开剂
Rf > 0.02 ，A 、B可分离. 与标样比较可定性鉴定
. 如果两种氨基酸的迁移速率相近，
或者氨基酸的Rf值相同，如何来分
离？
氨基酸的Rf值
展开剂 正丁醇+吡啶+水
名称
分离原理
固定相只能与一种待分离
亲和层析法 组份专一结合，以此和无 亲和力的其它组份分离
层析法的分类
• 按操作形式不同分类
名称
操作形式
柱层析法 固定相装于柱内，使样品沿着 一个方向前移而达分离
纸层析法 用滤纸作液体的载体，点样后 用流动相展开，使各组份分离
将适当的高分子有机吸附剂制成 薄膜层析法 薄膜，以类似纸层析方法进行物
加入样品 层析后
实验：胡萝卜的 柱层析分离法
柱层析示意图
薄层吸附层析
( Thin layer absorption chromatography)
薄层吸附层析是将吸附剂 均匀地在玻璃板上铺成薄层， 再把样品点在薄层板上，点样 的位置靠近板的一端。然后将 板的这端浸入适当的溶剂(流 动相)中，使溶剂在薄层板上 扩散，并在此过程中通过吸附 →解吸→再吸附→再解吸的反 复进行，而将样品各个组分分 离出来。
层析技术的分类
层析的分类：
1. 按两相所处物理状态分类
气相层析：气液层析（固定相为液体）和气固层析（固定相为固体），流动相为气体。
液相层析：液液层析（固定相为液体）和液固层析（固定相为固体），流动相为液体。
2. 按层析方式分类
柱层析：固定相装于柱内，使样品沿着一个方向移动而分离。
薄层层析：将适当粘度的固定相均匀铺在薄板上，点样后，用流动相展开。
纸层析：用滤纸作液体的载体，点样后用流动相展开。
3. 根据层析原理分类：常用分类法
（1）吸附层析：固定相是固体吸附剂，通过对不同溶质吸附力强弱不同进行分离。
（2）分配层析：利用两相中的分配系数不同。
分配系数：当一种溶质在两种给定的互不相溶的溶剂中分配时，在一定温度下达到平衡后，溶质在两相中的浓度比值为一常数，即分配系数（Kd）
Kd＝Ca / Cb
Ca和Cb分别代表某一物质在互不相溶的两相，A相（动相）和B相（静相）中的浓度。
（3）离子交换层析：固定相是离子交换剂，各组分与其亲和力不同
（4）凝胶层析：固定相是多孔凝胶，根据流动相中溶质的分子量大小差异进行分离（5）亲和层析：利用固定相载体表面偶联具有特殊亲和作用的配基，与溶质分子发生可逆的特异性结合进行分离
（6）金属螯合层析
（7）疏水层析
（8）反相层析。
实验 色素的分离(层析法)
实验色素的分离(层析法)一、目的要求1．进一步了解绿叶中色素的组成及各色素的颜色和性质。
2．学会用层析法分离色素的操作技术，了解层析分析的有关知识。
二、实验原理层析分离技术是一种物理分离方法，按分离原理的不同，层析法可分为吸附层析、分配层析、离子交换层析、亲和层析等数种方法。
按操作方式的不同，又可分为柱型、薄层和纸型。
在本实验中采用柱吸附层析法分离叶色素，由于叶色素中各色素被吸附剂吸附的程度不同以及它们被溶剂溶解的能力不同，所以在层析柱中向下移动的距离不同而得以分离。
用适当的溶剂如石油醚、甲醇、丙酮、苯等，可将绿叶中的色素（叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素、叶黄素）提取出来，提取液通过吸附柱将其中的各种色素分开，吸附柱常用蔗糖、碳酸钙、氧化铝等吸附剂制成。
三、实验器材抽滤瓶、研钵、带托玻璃棒、层析柱(20㎝×1㎝)、分液漏斗、烧杯，具塞试管。
40 ℃烘干的菠菜叶、脱脂棉四、实验试剂1.石油醚2.甲醇3.苯4.无水硫酸钠5.细粉状蔗糖6.无水碳酸钙7.氧化铝8.海砂五、操作步骤1．取烘干的菠菜叶1 g置于研钵中，加少许海砂研碎。
浸入含有22.5 mL 的石油醚、2.5 mL苯和7.5 mL甲醇的混合溶剂中，放置约1 h。
2．将上述溶液置于分液漏斗中，加5 mL水轻轻上下颠倒数次，静置后弃去水层（其中溶有甲醇），应避免剧烈振荡，否则发生乳化现象。
将剩余的液体通过装有无水硫酸钠（5 g）的漏斗过滤除去水分，即得到色素提取液(必要时可在通风橱中小心浓缩)。
提取液于干燥的试管中保存，并用塞子将试管塞紧。
3．取层析柱1支（也可用25 mL酸式滴定管代替），在下端塞上一块脱脂棉，将约2 g细粉状氧化铝装入柱中，每装少许就用带托的玻璃棒压紧，尤其四周要与柱壁紧密相接，不得留有空隙。
装到3 cm高为止。
用同样的方法装入约2.5 g 细粉状碳酸钙，高度为5 cm，然后再用同样的方法将约3.5 g的细蔗糖粉末装入柱内，高度为7 cm。
9种层析分离纯化方法详解
9种层析分离纯化方法详解层析法是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术。
所有的层析系统都由两个相组成：一是固定相，它或者是固体物质或者是固定于固体物质上的成分；另一是流动相，即可以流动的物质，如水和各种溶媒。
当待分离的混合物随溶媒（流动相）通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，而且随溶媒向前移动，各组份不断地在两相中进行再分配。
与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移动的速度快。
反之，与固定相相互作用越强的组份，向前移动速度越慢。
分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组份，从而达到将各组份分离的目的。
按层析原理可将层析分为以下9种：1、亲和层析利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力，从而达到分离的目的。
将可亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂，当含混合组分的样品通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结合，性无关组分随流动相流出。
改变流动相组分，可将结合的亲和物洗脱下来。
亲和层析中所用的载体称为基质，与基质共价连接的化合物称配基。
具有专一亲和力的生物分子对主要有：抗原与抗体，DNA与互补DNA或RNA，酶与底物、激素与受体、维生素与特异结合蛋白、糖蛋白与植物凝集素等。
亲和层析可用于纯化生物大分子、稀释液的浓缩、不稳定蛋白质的贮藏、分离核酸等。
亲和层析纯化的分离原理特点：亲和层析具有高选择性、高纯度、快速、浓缩等特点，在重组蛋白的分离中多作为第一步的粗纯，实现对绝大部分杂质蛋白的去除。
2、离子交换层析采用具有离子交换性能的物质作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆交换的性质来分离离子型化合物的方法。
主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其他带电荷的生物分子。
不同蛋白质的等电点（pI，isoelectric point）特性，使在不同pH缓冲液条件下所带正/负净电荷不同，选择不同的离子交换柱实现分离。
生物化学实验层析技术和原理
层析技术一、层析技术是利用混合物中各组分理化性质的差别（分子亲和力、吸附力、分子的形状和大小、分配系数等），使各组分以不同程度分布在两个相，其中一个是固定相，另一个是流动相，从而使各组分以不同速度移动而使其分离的方法。
二、常用的层析技术有亲和层析、吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、分配层析五种。
层析方法分类表（l ）层析柱层析柱一般为玻璃管制成，其下端为细口，出口处带有玻璃烧结板或尼龙网。
柱的直径和长度之比是1：10~40层析柱的内壁直径大于1cm ，以防产生“管壁效应”，即由于流动分子在柱中心移动慢，沿管壁移动快，而使区带成为凸形的现象。
当层析的目的是要把小分子物质分离开，则层析柱体积应是样品体积的4一10倍。
高度与直径比是5:1一15:1。
当层析的目的是要分离大分子物质时，则层析柱的体积应为样品体积的25—100倍，高度直径比为一100:1。
）（2）恒流装臵在层析过程中，必须保证流动相流过固定相。
因此试剂的加人必须有恒流装臵加以控制。
最简单的恒流装臵是恒压瓶（Mariotte 瓶）这实际上是一下口瓶，其塞上插人一根玻璃管。
它通过密封的层析柱和环境之间大气压的平衡来控制洗脱液的流速。
当洗脱液流出瓶子后，在剩下的溶液顶部就产生部分真空，管A 内溶液的水平面就下降，当下降到管的末端，空气就进人容器，出现气泡。
管A 最下端压力等于大气压。
静水压是从B 点算起，与瓶中溶液深度无关。
这个压力恒定的，因此洗脱液的流三、1、柱层析的设备洗脱液扌尼龙网 检测器 记录仪1M o自动部分收集器寻呂一洗观液玻璃棉 ~层析柱萍一固定相 恒液泵柱层析的基本设备有层析柱，恒流装臵（恒流泵，它可以产生均一的流速，并且流速是可调的）和接收装臵。
出速度是恒定的。
恒压瓶装臵简单，但洗脱液流出速度不好整制。
另一种恒流装臵是恒流泵，它可以产生均一的流速，（3）接受装臵洗脱液的接收可以手工用试管一管一管地接。
不过最好使用部分收集器，这种仪器带有上百支试管，可准确定时换管、自动化程度很高。
实验五 层析实验
分子量适用范围为1，500～30，000。
血红蛋白本身有红色，鱼精蛋白无色，故将黄色的DNP（2，4–二 硝基氟苯）偶联于鱼精蛋白，使其着色，便于观察。
【操作步骤】 1．凝胶的准备 称取l g Sephadex G–50，置于锥形瓶中，加蒸馏水30ml， 沸水浴中放置1小时，冷至室温备用。 2．装柱 取直径0.8～1.2cm，长25～30cm的层析柱一支，垂直安装于铁 架台上。底部填少许玻璃纤维，下部装一“再”形夹以调节流速（见 图4-1）。首先关闭“再”形夹，自顶部缓缓加入上述备用的 Sephadex G–50 悬液，待底部凝胶沉积1～2cm时，打开“再”形夹， 并边缓加Sephadex G–50悬液，边调整适当流速，至凝胶层积集约 18cm高，停止加Sephadex G–50悬液，连通洗脱液，进行平衡（调整 流速）。操作过程中，应防止气泡进入和凝胶分层现象。 3．样品制备 临上样前，将0.3ml血红蛋白溶液和0.5ml DNP–鱼精蛋白溶 液混匀即可。 4．加样与洗脱 切断洗脱液，当层析柱中液面下降与凝胶表层平齐时， 即用滴管将样品液缓缓沿柱壁加入，不使凝胶表层扰动，待样品液面 与凝胶表层平齐时，再加少许蒸馏水，开始洗脱。注意观察层析柱中 红色的血红蛋白与黄色的DNP–鱼精蛋白分离的情况，记录现象。
【操作步骤】
1．填料的预处理：在一只100ml烧杯中，置约10g树脂，加2M HCl 25ml，
搅匀，放置2小时，倾弃上层酸液，蒸馏水洗3次，再加2 M NaOH 25ml， 搅匀，放置2小时，倾弃上层碱液，用蒸馏水洗至中性（pH试纸检查）。 将树脂悬浮于大约50ml pH 2.2的0.1M柠檬酸缓冲液中备用。
影响氨基移换过程的观察，因此在反应体系中添加一碘醋酸(或 一溴醋酸)以抑制谷氨酸和丙酮酸的其他代谢过程。
四种层析方法
四种层析方法层析方法是一种将混合物中的化合物分离出来的方法。
这种技术通过利用化合物在固定相和移动相之间的不同亲和性来实现分离。
层析方法因其简单性和广泛的适用性而成为化学、生物化学和制药学中最基本的分离技术之一。
本文将介绍四种常见的层析方法，包括薄层层析法、气相层析法、离子交换层析法和凝胶层析法。
这些方法将被讨论其原理、应用、实施步骤和优缺点。
一、薄层层析法薄层层析法（TLC）是一种快速、低成本的液相分离技术。
该技术将被分析物和固定相通过一个毛细管作为裂隙分裂（slit split），使用一层非极性或极性的固定相作为分离基质，包括硅胶、氧化铝和氢氧化铝。
被分离的化合物随着移动液相在固定相上移动，不同化合物基于其不同亲和性分配到不同位置上。
该方法的实施步骤包括样品的准备、涂抹和显色步骤。
样品通常被溶解在一个合适的溶剂中，并用玻璃毛细管将其施加到固定相上。
一旦样品施加到固定相上，被分离的化合物将随着移动液相在固定相上移动。
显色可以通过利用化学试剂或紫外线进行检测。
TLC 广泛应用于化学、生物化学和制药学中，用于分析中等大小的有机和无机化合物，如氨基酸、脂肪酸、天然产物和药物。
优点：TLC是一种快速、低成本的分离技术，对于中等大小的化合物具有很好的分离效果。
TLC可以用于大规模样品纯化，并且可以被用于对化合物混合物进行初步分析的快速筛选。
缺点：TLC存在分离效率低和灵敏度低的问题，并且与其他层析技术相比，其分辨率相对较低。
TLC在数据分析方面存在可重复性差的问题。
二、气相层析法气相层析法（GC）是一种对挥发性和半挥发性化合物进行分离的技术。
此方法使用长列的液体或固定相，将待分离的化合物从液态或气态的样品中吸附并分离出来。
通过加热样品，在固定相中获得了一个气态分离的组分，可以将化合物通过检测器进行检测。
该方法通常使用非极性液态或固态固定相，如聚硅氧烷或聚乙二醇。
GC也可以选择更具有极性的固定相，从而实现对更极性化合物的分离。
层析分析技术在生命科学中的应用
层析分析技术在生命科学中的应用生命科学是一个综合性的领域，涉及到了分子生物学、生物化学、细胞生物学、遗传学、药物学等多个学科。
随着科技的不断进步，人们对于生命科学的认识也越来越深入。
其中，层析分析技术是生命科学中一种广泛应用的技术，其广泛应用于蛋白质纯化、酶学研究、分子诊断、药物筛选等领域。
一、层析分析技术简介层析分析技术是一种将混合物中各成分分离开来的技术。
该技术根据成分分子在不同吸附材料上的亲和力差异，通过流经这些材料的溶液轮廓分离成分，从而达到纯化的目的。
层析技术包括不同类型的液相层析、气相层析、离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤层析等方法。
不同类型的层析技术因吸附选择性及吸附条件不同而互相区分。
二、层析分析在生物大分子纯化中的应用DNA、RNA和蛋白质等生物大分子是生命科学中的基本元素，对于这些分子的研究，纯化是必不可少的一步。
生物大分子的分离纯化主要基于其不同的性质进行。
蛋白质的性质包括分子量、异构体、电荷、亲和性和溶解度。
层析分析技术可以根据不同的蛋白质特性进行选择，从而实现对蛋白质的纯化。
离子交换层析是蛋白质纯化中最常用的层析技术之一。
离子交换层析通过杂质蛋白质、多肽、核酸、盐和其他杂质分离出纯化的目标蛋白质。
离子交换层析可用于纯化负电荷（酸性）和正电荷（碱性）蛋白质。
其实现方法是将样品注入填充有磷酸纤维素、硫酸纤维素、乳清蛋白、DEAE - 硫酸纤维素以及CM - 硫酸纤维素等电荷大分子的固相载体中，利用不同的缓冲液中不同pH下离子交换材料带电荷的环境作用使之分离。
这种方法比较突出的优点是高纯度，且样品准备简便，但需慎重控制pH梯度。
亲和层析是另一种常用的层析技术，它是以靶蛋白质与提供特异性亲和力的吸附剂之间的高亲和性为基础分离纯化。
目前应用较广的亲和层析列是以蛋白质对于金属离子、亲和标记、抗体等化合物的亲和性为基础，选用填充有这些化合物的柱体来除去不具亲和力的非目的性蛋白质。
三、层析分析在药物研究中的应用随着基因工程和高通量策略的逐渐成熟，现代药物研究对于蛋白质药物的需求日益增加。
《亲和层析》课件
流动相可以是缓冲液、有机溶剂等
亲和层析可以分离纯化生物大分子，如蛋 白质、核酸、多糖等
亲和层析的应用广泛，如蛋白质纯化、药 物筛选、生物检测等
03
亲和层析的实验流 程
亲和层析的实验准备
材料准备：亲和 层析柱、缓冲液、 样品、洗脱液等
设备准备：层析 仪、离心机、紫 外分光光度计等
亲和层析的应用领域
生物制药：分离 纯化蛋白质、多 肽等生物大分子
食品工业：分离 纯化食品添加剂、 天然色素等
环境监测：分离 纯化重金属离子、 有机污染物等
化学分析：分离 纯化有机化合物、 无机化合物等
亲和层析的基本原理
亲和层析是一种分离纯化生物大分子的方 法
原理：利用生物大分子与固定相之间的亲 和力进行分离
06
亲和层析的发展趋 势和展望
亲和层析技术的未来发展方向
提高分离效率：通过改进亲和层 析技术，提高分离效率，降低成 本
智能化发展：结合人工智能技术， 实现亲和层析的自动化、智能化
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扩大应用领域：将亲和层析技术 应用于更多领域，如生物制药、 食品加工等
环保化发展：采用环保材料和工 艺，降低对环境的影响，实现可 持续发展
亲和层析在生物医药领域的应用
蛋白质纯化： 分离、纯化蛋 白质，提高纯
度
药物筛选：筛 选药物，提高 药物研发效率
疫苗生产：分 离、纯化疫苗， 提高疫苗质量
诊断试剂：制 备诊断试剂， 提高诊断准确
性
亲和层析在环境监测领域的应用
土壤监测：检测土壤中的污 染物，如农药残留、重金属 等
大气监测：检测大气中的污 染物，如二氧化硫、氮氧化
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基本概念
固定相：固定相是层析的一个基质。它可以是固体物 质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液 体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基 质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换 等作用。
流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质 朝着一个方向移动的液体、气体等，都称为流动相。 柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。
迁移率
迁移率（ Rf或比移值）是指：在一定条件下， 在相同的时间内某一组分在固定相移动的距离与 流动相本身移动的距离之比值 。常用Rf来表示
实验中我们还常用相对迁移率的概念。相对迁移率 是指：在一定条件下，在相同时间内，某一组分在 固定相中移动的距离与某一标准物质在固定相中移 动的距离之比 值。常用Rx来表示
层析系统都由两个相组成：一是固定相，它或者是固体物质或 者是固定于固体物质上的成分；另一是流动相，即可以流动的 物质，当待分离的混合物通过固定相时，由于各组份的理化性 质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的 能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，与固定相相互 作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前 移动的速度快。反之，与固定相相互作用越强的组份，向前移 动速度越慢。分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组 份，从而达到将各组份分离的目的。
❖ K值小表示某溶质在流动相中浓度 大，故在洗脱液中出现较早
❖ 有相似的K值，则表明两组分层析峰 会发生重叠，分离效果差
分配系数主要与下列因素有关： ①被分离物质本身的性质 ②固定相和流动相的性质 ③层析柱的温度。
不同的层析机理，其K值函义不同:
❖ 吸附层析中K值表示吸附平衡常数 ❖ 分配层析中K值表示分配系数 ❖ 离子交换层析中K表示交换常数 ❖ 亲和层析中K表示亲和常数。
分配系数（distribution coefficient）
分配系数是指在一定的条件下（如温度、压力）， 某种组分在固定相和流动相中含量（浓度）的比 值，分配系数是层析中分离纯化物质的主要依据， 常用K来表示
K cs cm
Cs: 溶质在固定相中的浓度，Cm:溶质在流动相中的浓度
❖ K值大表示其溶质在固定相中浓度大， 在洗脱过程中溶质出现较晚
4、按照不同的标准层析法有不同的分类。 根据层析峰的位置及峰高或峰面积,可以定 性及定量。层析法与光学、电学或电化学 仪器连用，可检测出层析后各组份的浓度 或质量，同时绘出层析图。层析仪与电子 计算机联用，可使操作及数据处理自动化， 大大缩短分析时间。
5、由于层析法具有分辨率高、灵敏度高、选择性好、 速度快等特点，因此适用于杂质多、含量少的复杂样 品分析，尤其适用于生物样品的分离分析。近年来， 已成为生物化学及分子生物学常用的分析方法。在医 药卫生、环境化学、高分子材料、石油化工等方面也 得到了广泛的应用。
分配系数与迁移率的关系
❖ K值大，就表明该组分与固定相结合力大，迁移率小； 反之则结合力小，迁移率大
❖ K增加，Rf减少；反之，会减少，Rf增加
❖ 不同物质的分配系数或迁移率是不同的。分配系数 或迁移率的差异程度是决定几种物质采用层析方法能 否分 离的先决条件。其差异越大，分离效果越理想。
操作容量：在特定条件下，某种成分与基质反应达 到平衡时，存在于基质上的饱和容量。每克（或毫 升）基质结合某种成分的毫摩尔数（或毫克数）。 数值大，结合力强。
层析包括吸附层析分配层析离 子交换层析亲和层析等演示文
稿
一、简介
1、层析法也称色谱法，是 1906年俄国植物学家 Michael Tswett发现并命 名的。他将植物叶子的色素 通过装填有吸附剂的柱子， 各种色素以不同的速率流动 后形成不同的色带而被分开， 由此得名为“色谱法” （Chromatography) 。后 来无色物质也可利用吸附柱 层析分离。
将适当的高分子有机吸附剂制成薄 膜，以类似纸层析方法进行物质的 分离
凝胶层析
（gel chromatography）
凝胶排阻层析（gel exclusion chromatography） 分子筛层析（molecular sieve chromatography） 凝胶过滤（gel filtration） 凝胶渗透层析（gel permeation chromatography）
膨胀度（Vβ)： 在一定溶液中，单位重量的基质充 分溶胀后所占有的体积；即每克溶胀基质所具有的处状态分类
2、按层析原理分类
名称 吸附层析法 分配层析法 离子交换层析法 凝胶层析法
亲和层析法
分离原理
组份在吸附剂表面吸附固定相是固体吸附 剂，各能力不同 各组份在流动相和静止液相（固相）中的 分配系数不同 固定相是离子交换剂，各组份与离子交换 剂亲和力不同 固定相是多孔凝胶，各组份的分子大小不 同，因而在凝胶上受阻滞的程度不同
2、层析法是目前广泛应用的一种分离技术， 是分离各种生物大分子的主要手段之一，是 利用不同物质理化性质的差异而建立起来的 技术。
3、40年代：两位英国科学家Martin和 Synge发明了分配色谱（层析），他们首先 提出了色谱塔板理论，获得了1952年的诺 贝尔化学奖。由此，层析技术成为分离生化 物质的关键技术。
6、在层析法实验技术有凝胶层析法、离子交换层析 法、高效液相层析法、亲和层析法、聚焦层析法等
二、原理及概念
层析技术是一类物理分 离方法,根据待分离混合 物中各组分物理化学性 质的差别,使各组分以不 同程度分布在固定相和 流动相两相中,由于各组 分随流动相前进的速度 不同,从而得到有效分离。
例如：我们利用物质在溶解度、吸附能 力、立体化学特性及分子的大小、带电 情况及离子交换、亲和力的大小及特异 的生物学反应等方面的差异，使其在流 动相与固定相之间的分配系数（或称分 配常数）不同，达到彼此分离的目的。
固定相只能与一种待分离组份专一结合， 以此和无亲和力的其它组份分离
3、按操作形式不同分类
柱层析法
名称
薄层层析法
纸层析法 薄膜层析法
操作形式
固定相装于柱内，使样品沿着一个 方向前移而达分离
将适当粘度的固定相均匀涂铺在薄 板上，点样后用流动相展开，使各 组份分离
用滤纸作液体的载体，点样后用流 动相展开，使各组份分离