铁皮石斛组培方案

铁皮石斛组织培养方案报告

一、实验目的

了解铁皮石斛培养的方法和步骤，熟练掌握外植体的取材、消毒、接种、初代培养的操作过程。

二、实验器材

超净工作台、高压灭菌锅、电磁炉、长镊子、培养皿、酒精灯、接种工具、烧杯、玻璃棒、移液管、培养箱、剪刀、培养瓶等。

三、实验步骤

配方：

根据不同阶段，培养基配方有所差异。如表1

表1各种培养基配方

配制（以1000ml幼株的生根壮苗培养基为例）

10%香蕉（w/w）+MS +3%蔗糖（w/w）+%琼脂（w/w）+L NAA

1）量取800ml蒸馏水于洁净的大烧杯中，加热至沸腾；

2）准确称量100g香蕉果肉，切成碎片状，并倒入上述烧杯中，加热煮沸5mi n，其间搅拌使之充分溶解；

3）按照大量、微量、卩£+盐、有机I、有机U顺序，量取MS各种母液于盛有50ml蒸馏水的烧杯，混合均匀；

4）将2）和3）的溶液混合，然后加入30g蔗糖，并移取2ml NAA （ml），混合均匀；

5）加热至沸腾，加入8g琼脂并煮沸5min，其间不断搅拌使之充分溶解；

6）冷却至50± 5C时，调pH至一。分装于培养瓶内，瓶。注意事项：

①溶解香蕉的蒸馏水尽可能多，以确保香蕉各种成分完全溶解；

②各种母液混合时，要按照大量、微量、F/盐、有机I、有机U的顺序；

③煮沸时，小心溶液溢出；

④分装时不要污染培养瓶瓶口。

灭菌：

1）检查灭菌锅的水位、电源、排气阀、排气管、安全阀以及压力表，确保灭菌锅各指标和功能的正常，以防事故发生；

2）把带灭菌的培养基装入锅内，盖上锅盖，对称而均匀地扭紧螺丝；

3）打开电源和排气阀，调节电压至220V;

4）待排气阀排除水蒸气30s—1min后，关闭排气阀；

5）当温度上升到121C后，调节电压至135V,保持20min；

6）关闭电源，使之自动降温至0C。10min后，打开排气阀和锅盖；

7）5—10min后，取出培养基放于试验台上冷却，待用

表2灭菌时间统计

注意事项：

①启动灭菌前，应检查水位、电源、排气阀、安全阀、排气管等，确保正常；

②灭菌锅底部应铺垫一层报纸，以防培养瓶机械破损；

③灭菌电压不宜超过220V,否则灭菌锅会剧烈摇晃，造成不必要的损害和安全隐患；

④当温度达到121C后，调节电压至135V,并且时不时注意温度的变化，确保温度介于

121-122 C之间;

⑤气压降至0后，不宜立即揭盖；最好在5-10min后揭盖，这样才能缓和内外"气压和温度差”；

⑥揭盖5-10min后，再转移锅内培养基，以免烫伤。

⑦每锅只能灭菌18瓶

转接

转接前准备

1）培养皿、镊子、剪刀等转接用具的灭菌（可以在培养基灭菌时附带）；

2）检查超净台内各种用具，及时补充酒精灯的酒精，确保用具齐全；

3）放置待转接材料和待接入培养基，以“方便操作为宜”而陈列；

转接

1）揭去防尘膜，打开电源、通风和紫外灯，灭菌15—20min ；

2）关掉紫外，打开白炽灯，用75%酒精仔细擦拭手指、指甲、材料瓶瓶盖及盖边缘、工作区等处，确保“消毒”彻底；

3）点燃酒精灯，用无菌镊子把材料夹取于无菌培养皿内，挑选生命力旺盛的植株用于转接；

4）用无菌剪刀修去多余的根系，“双镊子”法将材料转接于新的培养基中；

5）标注相关日期和品系，转至培养室培养。

注意事项

①操作时，所有用具均不能从“核心工作区”和开启的培养瓶上面晃过，防止细菌落入

而导致污染；

②在打开材料瓶和培养瓶后，其盖均在酒精灯外焰灼烧3-5S ,瓶口灼烧5-10S ；盖瓶盖

时，亦如此操作；

③转接时，确保手一直在超净台内，以免带入外界细菌。

培养：

培养条件：白炽灯12h/黑暗12h + 20 C

PDA培养基的配制方法，培养基的湿热灭菌操作

、目的要求

1．学习并掌握配制培养基的一般方法和步骤。

2．学习并掌握棉塞的制作方法。

二、培养基的配制原理培养基是人工配制的各种营养物质供微生物生长繁殖的基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。在自然界中，微生物种类繁多，营养类型多样，加上实训和研究的目的不同，所以培养基的种类很多，但不论是何种培养基，均应含有水分、碳源、氮源、能源、无机盐等。不同微

生物对pH 值要求不一样，所以配制培养基时，还应根据不

同微生物对pH值的要求，将培养基调到合适的pH值范围。

三、实训材料和用具

琼脂，可溶性淀粉，葡萄糖，10 % NaOH 10% HCI, 1mol/L NaOH lmol /L HCI, KNO,

NaCI, K?HPO・ 3f0, MgSO4 7f0, FeSO • 7fO;试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻璃棒，天平，牛角匙，PH试纸，棉花，牛皮纸，记号笔，纱布，

四、操作方法与步骤

(一) 培养基的配制

PDA培养基的配制其配方如下：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂15〜20g，水1000mL, pH值自然。

(1)称量和熬煮药品实际用量计算后,按培养基配方逐一称取去皮土豆。土豆切成小

块放入锅中，加水1000ml，在加热器上加热至沸腾，维持20 - 30min，用可用2层纱布趁热

在量杯上过滤,滤渣弃取。滤液补充水分到1000mI。

(2)加热溶解把滤液放入锅中，加入葡萄糖20g,琼脂15〜20g (提前搞碎)，然后放在石棉网上,小火加热,并用玻棒不断搅拌,以防琼脂糊底或溢出,待琼脂完全溶解后,再补充水分至所需量。

(3)分装按实训要求,将配制的培养基分装入试管或500mI 三角瓶内。分装时可用三角漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上造成污染。

分装量：固体培养基约为试管高度的1／5,灭菌后制成斜面,分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜;半固体培养基以试管高度的1／3为宜,灭菌后垂直待凝。

(4)加棉塞培养基分装完毕后,在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞(或泡沫塑料塞或试管帽等),以阻止外界微生物进入培养基内造成污染,并保证有良好的通气性能。

(5)包扎加塞后,将全部试管用麻绳或橡皮筋捆好,再在棉塞外包一层牛皮纸,以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞, 其外再用一道线绳或橡皮筋扎好, 用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。

( 二) 棉塞的制作棉塞的作用有二：一是防止杂菌污染;二是可过滤空气,保证通气良好,并可减缓培养基水分的蒸发,所以正确地制备棉塞是培养基制备中重要的一环。正确的棉塞是形状、大小,松紧应与试管口(或三角烧瓶)完全适合。过紧则妨碍空气流通,操作不便;过松时,空气会毫无