发酵工程青霉素的制备
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• 发酵开始前，有关设备和培养基（主要是碳源、氮源、前 体和无机盐等）必须先经过灭菌，后接入种子。
• 在整个过程中，需要不断通气和搅拌，维持一定的罐温和 罐压，在发酵过程中往往要加入泡沫剂，假如酸碱控制发 酵液的PH，还需要间歇或连续的加入葡萄糖及铵盐等化合 物以补充碳源及氮源，或补进其他料液和前体等以促进青 霉素的生产。
➢ 温度。前期25℃ ~26℃ ，后期23℃ 。
➢ 溶解氧。不低于饱和溶解氧的30%。 ➢ 泡沫的控制。
• 基质浓度：在分批发酵中，常常因为前期 基质量浓度过高，后期基质浓度低，对生 物合成酶系产生阻遏或对菌丝生长产生抑 制。为了避免这一现象,在青霉素发酵中 通常采用补料分批操作法,即对容易产生 抑制和限制作用的基质维持一定的最适浓 度。
• 菌丝浓度：发酵过程中必须控制菌丝浓度不 超过临界菌体浓度, 从而使氧传递速率与氧 消耗速率在某一溶氧水平上达到平衡。
• 菌丝生长速度：在葡萄糖限制生长的条件下， 当比生长速率低于0.015h-1时，比生产速率 与比生长速率成正比。因此, 要在发酵过程 中达到并维持最大比生产速率,必须使比生长 速率不低0.015h-1。
• 青霉素发酵——将青霉菌接种到固体培养 基上培养一段时间，得到青霉菌孢子培养 物。用无菌水将孢子制成悬浮液接种到种 子罐内已灭菌的培养基中，通入无菌空气 搅拌，培养。然后将种子培养液接种到发 酵罐已灭菌的含有苯乙酸前体的培养基中， 通入无菌空气搅拌，培养。
二、 青霉素发酵过程
• 青霉素发酵时，青霉素生产菌在合适的培养基、PH、温度 和通气搅拌等发酵条件下进行生长并合成青霉素。
• 苯乙酸/苯乙酰胺：可以借酰基转移的 作用，将苯乙酸转入青霉素分子，提 高青霉素的生产强度。
• P和S：为菌体提供营养的无机磷源一 般采用磷酸二氢钾。另外加入硫代硫 酸钠或硫酸钠以提供青霉素分子中所 需的硫。
• 另外，由于在发酵过程中二氧化碳的不断产 生，加上培养基中有很多有机氮源含有蛋白 质，因此在发酵罐内会产生大量泡沫，如不 严加控制，就会产生发酵液逃液，导致染菌 的后果。采用植物油消沫是个好方法，一方 面作为消沫剂，另一方面还可以起到碳源作 用。
在赖氨酸生物合成途径中，从氨基己二酸 分支而产生青霉素，这种赖氨酸阻遏是初级代 谢调节的效果用到次级代谢上的最好的例子。
➢青霉素的生物合成与糖分解代谢 的关系
青霉素的生物合成受糖分解代谢产物 的阻遏，如合成青霉素的酰基转移酶就会 被阻遏。在青霉素发酵过程中，发现能被 青霉素迅速利用的葡萄糖有利于菌体生长， 但抑制青霉素的合成，而被缓慢利用的乳 糖，却是生产青霉素的最好碳源。
青霉素发酵过程中的代谢变化分为菌体生长、 青霉素合成和菌体自溶三个阶段。
• 菌体生长阶段：发酵培养基接种后生产菌在合 适的环境中经过短时间的适应，即开始发育、 生长和繁殖，直至达到菌体的临界浓度。
• 青霉素合成阶段：这个阶段主要合成青霉素， 青霉素的生产速率达到最大，并一直维持到青 霉素合成能力衰退。在这个阶段，菌体重量有 所增加，但产生菌的呼吸强度一般无显著变化。
• 由于现在还有一些工厂采用铁罐发酵，在发 酵过程中铁离子便逐渐进入发酵液。发酵时 间愈长，则铁离子愈多。铁离子过多会影响 青霉素的合成。采用铁络合剂以抑制铁离子 的影响，但实际对青霉素产量并无改进。所 以青霉素的发酵罐采用不锈钢制造为宜。
乳糖比葡萄糖优越的主要原因是乳糖
被水解成单糖的速度正好符合青霉素生产 期合成青霉素的需要，而又不会产生高浓 度的分解产物来抑制青霉素的合成，因此， 碳源多用葡萄糖加乳糖或利用某些非糖原 料如植物油等。但由于乳糖价格较贵，成 本较高，故在生产实践中常通过间隙或滴 加葡萄糖的方法控制培养液中糖的含量， 以符合菌体生长和青霉素生物合成的需要。 这样，可以降低成本，提高产量。
青霉素是含有青霉素母核的多种化合 物的总称，青霉素发酵液中至少含有5 种以上的不同的青霉素：青霉素F、青 霉素X、青霉素K及二氢青霉素F等。
青霉素分子结构球棍模型
青霉素合成及调控
青 霉 素 的 生 物 合 成
➢青霉素的生物合成与赖氨酸的反馈调节
用产黄霉菌生产青霉素要受到赖氨酸的阻 遏，这是由于其赖氨酸生物合成途径的初始 酶——高柠檬酸合成酶受到了赖氨酸反馈阻遏。
➢ 无机盐包括硫、磷、钙、镁、钾等盐类。铁离子 对青霉素有毒害作用，应严格控制发酵液中铁含 量在30ug/mL以下。
青霉素生产工艺过程
抗生素制备的一般流程图
菌种
孢子制备 种子制备
发酵阶段
前体
发酵
发酵液预处理及种子加滤
提取及精制 成品检验
提取阶段
成品包装
发酵工艺流程
青霉素菌种发酵工艺的原理
一、总述
--青霉素类抗生素
➢青霉素简介
化学结构 理化性质
➢青霉素合成及调控
生物合成
生物来自百度文库成的调控
➢青霉素发酵生产工艺
菌种 发酵工艺流程 培养基 发酵培养控制
青霉素简介
青霉素的发现
1929年英国学者 弗莱明首先在抗 生素中发现了青 霉素，英国谢菲 尔德大学病理学 家弗洛里实现对 青霉素的分离与 纯化。
青霉素的化学结构
• 温度：青霉素发酵的最适温度一般认为应 在25 °C 左右。温度过高将明显降低发 酵产率,同时增加葡萄糖的维持消耗, 降 低葡萄糖至青霉素的转化率。
• pH值：青霉素发酵的最适pH 值一般认为 在6.5左右, 应尽量避免 pH 值超过7.0。 因为青霉素在碱性条件下不稳定,容易加 速其水解。
• 溶氧:对于好氧的青霉素发酵来说,溶氧 浓度是影响发酵过程的一个重要因素。 当溶氧浓度降到30%饱和度以下时,青霉 素产率急剧下降,低于10%饱和度时,则造 成不可逆的损害。溶氧浓度过高,说明菌 丝生长不良或加糖率过低,造成呼吸强度 下降,同样影响生产能力的发挥。
• 菌体自溶阶段：这个阶段菌体衰老，细胞开始 自溶，合成青霉素能力衰退，青霉素生产速率 下降，氨基氮增加，PH上升。
发酵培养控制
➢ 加糖控制。残糖降至0.6%，pH上升时加糖 ➢ 补氮及加前体。补氮：硫酸铵、氨、尿素，使发
酵液氨氮量控制在0.01%~0.05%。前体：发酵液中 残存乙酰胺浓度为0.05%~0.08%。 ➢ pH控制。6.6~6.4
青霉素分泌期 菌丝自溶期
培养基
➢ 碳源青霉菌能利用多种碳源如乳糖、蔗糖、葡萄 糖等。目前采用淀粉水解糖，糖化液进行流加。
➢ 氮源可采用玉米浆、花生饼粉、精制棉籽饼粉或 麸皮粉等有机氮源，及氯化氨、硫酸氨、硝酸氨 等无机氮源。
➢ 前体为生物合成含有苄基基团的青霉素G，需要 在发酵中加入前体如苯乙酸或苯乙酰胺。由于它 们对青霉素有一定毒性，故一次加入量不能大于 0.1%，并采用多次加入方式。
• 菌丝形态：青霉素产生菌分化主要呈丝状生 长和结球生长两种形态。在丝状菌发酵中, 控制菌丝形态使其保持适当的分支和长度, 并避免结球 , 是获得高产的关键要素之一。 而在球状菌发酵中, 使菌丝球保持适当大小 和松紧,并尽量减少游离菌丝的含量, 也是充 分发挥其生产能力的关键素之一。
• 碳酸钙：用来中和发酵过程中产生的 杂酸，并控制发酵液的pH值。
青霉素生产发酵工艺
菌种
目前国内青霉素生产菌按其在深层培养中 菌丝的形态分为丝状菌和球状菌两种，根 据丝状菌产生孢子的颜色又分为黄孢子丝 状菌和绿孢子丝状菌，常用菌种为绿孢子 丝状菌，如产黄青霉素。
青霉素产生菌的生长过程
分生孢子发芽期
菌丝繁殖期 脂肪粒形成期
菌丝生长期
脂肪粒减少，小空孢 大空孢 自溶
• 在整个过程中，需要不断通气和搅拌，维持一定的罐温和 罐压，在发酵过程中往往要加入泡沫剂，假如酸碱控制发 酵液的PH，还需要间歇或连续的加入葡萄糖及铵盐等化合 物以补充碳源及氮源，或补进其他料液和前体等以促进青 霉素的生产。
➢ 温度。前期25℃ ~26℃ ，后期23℃ 。
➢ 溶解氧。不低于饱和溶解氧的30%。 ➢ 泡沫的控制。
• 基质浓度：在分批发酵中，常常因为前期 基质量浓度过高，后期基质浓度低，对生 物合成酶系产生阻遏或对菌丝生长产生抑 制。为了避免这一现象,在青霉素发酵中 通常采用补料分批操作法,即对容易产生 抑制和限制作用的基质维持一定的最适浓 度。
• 菌丝浓度：发酵过程中必须控制菌丝浓度不 超过临界菌体浓度, 从而使氧传递速率与氧 消耗速率在某一溶氧水平上达到平衡。
• 菌丝生长速度：在葡萄糖限制生长的条件下， 当比生长速率低于0.015h-1时，比生产速率 与比生长速率成正比。因此, 要在发酵过程 中达到并维持最大比生产速率,必须使比生长 速率不低0.015h-1。
• 青霉素发酵——将青霉菌接种到固体培养 基上培养一段时间，得到青霉菌孢子培养 物。用无菌水将孢子制成悬浮液接种到种 子罐内已灭菌的培养基中，通入无菌空气 搅拌，培养。然后将种子培养液接种到发 酵罐已灭菌的含有苯乙酸前体的培养基中， 通入无菌空气搅拌，培养。
二、 青霉素发酵过程
• 青霉素发酵时，青霉素生产菌在合适的培养基、PH、温度 和通气搅拌等发酵条件下进行生长并合成青霉素。
• 苯乙酸/苯乙酰胺：可以借酰基转移的 作用，将苯乙酸转入青霉素分子，提 高青霉素的生产强度。
• P和S：为菌体提供营养的无机磷源一 般采用磷酸二氢钾。另外加入硫代硫 酸钠或硫酸钠以提供青霉素分子中所 需的硫。
• 另外，由于在发酵过程中二氧化碳的不断产 生，加上培养基中有很多有机氮源含有蛋白 质，因此在发酵罐内会产生大量泡沫，如不 严加控制，就会产生发酵液逃液，导致染菌 的后果。采用植物油消沫是个好方法，一方 面作为消沫剂，另一方面还可以起到碳源作 用。
在赖氨酸生物合成途径中，从氨基己二酸 分支而产生青霉素，这种赖氨酸阻遏是初级代 谢调节的效果用到次级代谢上的最好的例子。
➢青霉素的生物合成与糖分解代谢 的关系
青霉素的生物合成受糖分解代谢产物 的阻遏，如合成青霉素的酰基转移酶就会 被阻遏。在青霉素发酵过程中，发现能被 青霉素迅速利用的葡萄糖有利于菌体生长， 但抑制青霉素的合成，而被缓慢利用的乳 糖，却是生产青霉素的最好碳源。
青霉素发酵过程中的代谢变化分为菌体生长、 青霉素合成和菌体自溶三个阶段。
• 菌体生长阶段：发酵培养基接种后生产菌在合 适的环境中经过短时间的适应，即开始发育、 生长和繁殖，直至达到菌体的临界浓度。
• 青霉素合成阶段：这个阶段主要合成青霉素， 青霉素的生产速率达到最大，并一直维持到青 霉素合成能力衰退。在这个阶段，菌体重量有 所增加，但产生菌的呼吸强度一般无显著变化。
• 由于现在还有一些工厂采用铁罐发酵，在发 酵过程中铁离子便逐渐进入发酵液。发酵时 间愈长，则铁离子愈多。铁离子过多会影响 青霉素的合成。采用铁络合剂以抑制铁离子 的影响，但实际对青霉素产量并无改进。所 以青霉素的发酵罐采用不锈钢制造为宜。
乳糖比葡萄糖优越的主要原因是乳糖
被水解成单糖的速度正好符合青霉素生产 期合成青霉素的需要，而又不会产生高浓 度的分解产物来抑制青霉素的合成，因此， 碳源多用葡萄糖加乳糖或利用某些非糖原 料如植物油等。但由于乳糖价格较贵，成 本较高，故在生产实践中常通过间隙或滴 加葡萄糖的方法控制培养液中糖的含量， 以符合菌体生长和青霉素生物合成的需要。 这样，可以降低成本，提高产量。
青霉素是含有青霉素母核的多种化合 物的总称，青霉素发酵液中至少含有5 种以上的不同的青霉素：青霉素F、青 霉素X、青霉素K及二氢青霉素F等。
青霉素分子结构球棍模型
青霉素合成及调控
青 霉 素 的 生 物 合 成
➢青霉素的生物合成与赖氨酸的反馈调节
用产黄霉菌生产青霉素要受到赖氨酸的阻 遏，这是由于其赖氨酸生物合成途径的初始 酶——高柠檬酸合成酶受到了赖氨酸反馈阻遏。
➢ 无机盐包括硫、磷、钙、镁、钾等盐类。铁离子 对青霉素有毒害作用，应严格控制发酵液中铁含 量在30ug/mL以下。
青霉素生产工艺过程
抗生素制备的一般流程图
菌种
孢子制备 种子制备
发酵阶段
前体
发酵
发酵液预处理及种子加滤
提取及精制 成品检验
提取阶段
成品包装
发酵工艺流程
青霉素菌种发酵工艺的原理
一、总述
--青霉素类抗生素
➢青霉素简介
化学结构 理化性质
➢青霉素合成及调控
生物合成
生物来自百度文库成的调控
➢青霉素发酵生产工艺
菌种 发酵工艺流程 培养基 发酵培养控制
青霉素简介
青霉素的发现
1929年英国学者 弗莱明首先在抗 生素中发现了青 霉素，英国谢菲 尔德大学病理学 家弗洛里实现对 青霉素的分离与 纯化。
青霉素的化学结构
• 温度：青霉素发酵的最适温度一般认为应 在25 °C 左右。温度过高将明显降低发 酵产率,同时增加葡萄糖的维持消耗, 降 低葡萄糖至青霉素的转化率。
• pH值：青霉素发酵的最适pH 值一般认为 在6.5左右, 应尽量避免 pH 值超过7.0。 因为青霉素在碱性条件下不稳定,容易加 速其水解。
• 溶氧:对于好氧的青霉素发酵来说,溶氧 浓度是影响发酵过程的一个重要因素。 当溶氧浓度降到30%饱和度以下时,青霉 素产率急剧下降,低于10%饱和度时,则造 成不可逆的损害。溶氧浓度过高,说明菌 丝生长不良或加糖率过低,造成呼吸强度 下降,同样影响生产能力的发挥。
• 菌体自溶阶段：这个阶段菌体衰老，细胞开始 自溶，合成青霉素能力衰退，青霉素生产速率 下降，氨基氮增加，PH上升。
发酵培养控制
➢ 加糖控制。残糖降至0.6%，pH上升时加糖 ➢ 补氮及加前体。补氮：硫酸铵、氨、尿素，使发
酵液氨氮量控制在0.01%~0.05%。前体：发酵液中 残存乙酰胺浓度为0.05%~0.08%。 ➢ pH控制。6.6~6.4
青霉素分泌期 菌丝自溶期
培养基
➢ 碳源青霉菌能利用多种碳源如乳糖、蔗糖、葡萄 糖等。目前采用淀粉水解糖，糖化液进行流加。
➢ 氮源可采用玉米浆、花生饼粉、精制棉籽饼粉或 麸皮粉等有机氮源，及氯化氨、硫酸氨、硝酸氨 等无机氮源。
➢ 前体为生物合成含有苄基基团的青霉素G，需要 在发酵中加入前体如苯乙酸或苯乙酰胺。由于它 们对青霉素有一定毒性，故一次加入量不能大于 0.1%，并采用多次加入方式。
• 菌丝形态：青霉素产生菌分化主要呈丝状生 长和结球生长两种形态。在丝状菌发酵中, 控制菌丝形态使其保持适当的分支和长度, 并避免结球 , 是获得高产的关键要素之一。 而在球状菌发酵中, 使菌丝球保持适当大小 和松紧,并尽量减少游离菌丝的含量, 也是充 分发挥其生产能力的关键素之一。
• 碳酸钙：用来中和发酵过程中产生的 杂酸，并控制发酵液的pH值。
青霉素生产发酵工艺
菌种
目前国内青霉素生产菌按其在深层培养中 菌丝的形态分为丝状菌和球状菌两种，根 据丝状菌产生孢子的颜色又分为黄孢子丝 状菌和绿孢子丝状菌，常用菌种为绿孢子 丝状菌，如产黄青霉素。
青霉素产生菌的生长过程
分生孢子发芽期
菌丝繁殖期 脂肪粒形成期
菌丝生长期
脂肪粒减少，小空孢 大空孢 自溶