线粒体提取方法
线粒体提取步骤
线粒体提取步骤线粒体的提取步骤制备程序：a.组织匀浆：称取50-200 mg新鲜组织如肝脏、脑、心肌等，PBS冲洗，用剪刀剪为0.5cm2碎块放入小容量玻璃匀浆器内。
估计组织块总体积。
加入1.5 ml冰预冷的Mito Sdution。
上下研磨组织20次。
b. 培养细胞匀浆：消化细胞，PBS洗涤，800 × g 5~10 min离心收集细胞。
计数。
每次提取需要2-5 × 107个细胞。
加入1.5 ml冰预冷的Mito Sdution重悬细胞，将细胞悬液转移到小容量玻璃匀浆器内。
用间隙严密的研杵研磨细胞30-40次。
1. 将组织或细胞匀浆物转移到离心管。
800 × g 离心 5 min 4 ºC。
细胞核、大的膜碎片、未裂解细胞等在管底,弃去。
2. 收集上清液并转移到新的离心管。
800 × g 离心5 min at 4 ºC。
弃沉淀3. 将上清液转移到新的离心管。
10,000 × g 离心10 min 4 ºC。
离心后的上清含胞浆成分，将上清转移到新离心管，可收集用于对照实验。
线粒体沉淀在管底。
4. 洗涤线粒体：清除管内壁粘连的液体和碎片，加入0.2 ml Mito Sdution轻弹管底重悬线粒体沉淀，12,000 × g 离心10 min 4 ºC。
弃上清，线粒体沉淀在管底。
5. 用Mito Sdution或合适后续实验的自备缓冲液重悬线粒体沉淀50 µl/每100 mg组织或100 µl/5 × 107个细胞。
测定蛋白浓度。
立即使用或−70 ºC保存。
注意：1. 为保证获得完整的线粒体，第一是全程低温操作，将样品管放在冰水浴而不是碎冰块中。
第二是快速。
微量制备比大规模制备操作更方便和快速，因而更容易获得完整的线粒体。
第三，在不破坏亚细胞器的情况下破碎细胞是制备线粒体的最关键环节。
线粒体的提取与纯化
mt DNA的分离及纯化按戴建华等报道的方法，就具体情况稍加改进，步骤如下（除特别说明，均在4℃下完成）：1.1 取新鲜肝组织，放在缓冲液A（0.25M 蔗糖，0.01M Tris·Hcl，0.001M Na2-EDTA，pH8.0）中漂洗2~3次，尽可能去除表面血污、结缔组织及脂肪组织后剪碎。
按组织重﹕缓冲液A=1﹕5~10加入缓冲液A，用玻璃匀浆器冰浴匀浆。
1.2 1000 g•min-1离心15min；取上清液；15000 g•min-1离心20min，弃上清，沉淀用缓冲液B （0.25M 蔗糖，0.05M Tris·Hcl，0.007M Mg Cl2，p H7.5）洗涤，按0.5m L•g-1肝的比例加入缓冲液B 悬浮沉淀后加入DNase I 至终浓度为100 µg•m L-1，30℃下作用30min。
1.3 冰浴冷却，加入2倍体积的DNase I反应终止液（0.25M蔗糖，0.1M Na2-EDTA，pH8.0）。
15000g•min-1离心20min。
沉淀用DNaseI反应终止液洗涤一次，重复离心。
1.4 按0.5 m L•g-1肝加入缓冲液C（0.1M Nacl，0.05M Tris·Hcl，0.01M Na2-EDTA，p H8.5）悬浮沉淀，加入SDS至终浓度为1%~1.5%，吸打混匀后37℃保温15min。
1.5 用等体积的苯酚，苯酚/氯仿（1:1），氯仿/异戊醇（24:1）各抽提一次。
取水相，加0.2 倍体积1M Na Ac和2倍体积的预冷无水乙醇，混匀后放在4℃冰箱中过夜。
1.6 15000g•min-1离心30min后去上清；沉淀用70%乙醇洗涤2次，干燥，TE（0.01M Tris·Hcl，0.001M Na2-EDTA，pH8.0）溶解。
1.7 加入预处理的RNase I 至终浓度为50µg•m L-1，37℃保温1h。
线粒体DNA提取SOP
线粒体DNA提取SOP
一、蛋白酶K法
1、使用液氮将50mg新鲜组织样本研磨至粉末状；
2、转入1.5mL离心管中加入溶液A（4℃）1mL，冰浴中吹打分散后沉降大块沉淀；
3、4℃，1000r/min离心1min，分离颗粒细胞核和细胞碎片；
4、回收上清至新的1.5mL离心管，12000r/min离心10min；
5、弃上清，尽量去除干净；
6、加50uL蛋白酶K，55℃水浴2.5h，期间每隔15min轻轻混匀；
7、加水至500uL；
8、加入等体积的酚、氯仿、异丙醇抽提，轻柔上下翻转离心管15min；
9、1000r/min离心10min；
10、水相转移至新管并加入各500uL的氯仿和异丙醇，轻柔上下翻转离心管15min；
11、1000r/min离心10min；
12、水相转移至新管，加入2倍体积的冰乙醇沉淀，静置10min；
13、12000r/min离心2min，沉淀即为mtDNA；
14、70%乙醇清洗线粒体DNA，置于空气中自然干燥后加入适量TE液溶解，于4℃保存。
叶肉细胞的叶绿体和线粒体分离方法
叶肉细胞中的叶绿体和线粒体的分离通常依赖于差速离心技术，这是一种利用离心力通过不同密度和大小分离细胞器的方法。
叶绿体和线粒体可以通过粗破碎细胞获得粗提取液，然后通过离心分离纯化。
下面是一个标准的分离流程：1. 组织匀浆：收集新鲜的植物叶片，并在预冷的匀浆缓冲液中匀浆。
这个缓冲液通常包含适合的缓冲剂（如MOPS或HEPES），渗透压调节剂（如蔗糖或甘露醇），以及保护剂（如EDTA）来保护细胞器免受损坏。
匀浆过程应该足够温和，以避免损坏叶绿体和线粒体，但又足够强以破坏细胞以释放细胞器。
2. 过滤和初步离心：将匀浆液通过细目筛或纱布过滤以去除较大的细胞碎片和未破碎的细胞。
首先使用低速离心（例如1000 g左右，5-10分钟）去除细胞碎片和核。
3. 差速离心：收集上述低速离心后的上清液，然后在更高的速度下离心（例如5000-15000 g，10-20分钟），以沉淀叶绿体。
收集叶绿体沉淀，将上清液进行更高速度的离心（例如20000-50000 g，30分钟以上）以沉淀线粒体。
4. 洗涤和纯化：可以用同样的缓冲液轻轻重悬叶绿体和线粒体沉淀，并再次离心以清洗并进一步纯化。
可以重复上述离心步骤，或者使用密度梯度离心来进一步纯化叶绿体和线粒体。
5. 密度梯度离心（如果需要更高纯度的细胞器）：梯度通常使用蔗糖、过氧化氢或聚乙二醇等物质制备。
把叶绿体和线粒体悬浮液层叠在密度梯度上，然后进行高速离心，不同密度的细胞器会在梯度中不同的位置聚集。
6. 收集和存储：在密度梯度离心后，仔细收集不同密度的带，其中包含纯化的叶绿体和线粒体。
采集后的细胞器可在适当的缓冲液中存储于低温条件下，以保持其功能。
在整个过程中，细胞器的完整性和功能的保持是非常重要的，因此所有步骤都应在低温、缓冲的条件下轻柔地操作。
另外，根据研究目的，可能还需要添加特定的酶抑制剂或其他添加剂以保护细胞器免受损伤。
线粒体DNA的提取方法.
线粒体DNA的提取方法
Protocol for Extracting Mitochondria DNA
实验目的 从植物组织提取高纯度线粒体 DNA
实验原理
1、4000rpm 离心可以沉淀分离出叶绿体、 细胞核和组织碎片，12, 000 rpm离心才可 沉淀分离线粒体。 2、用蔗糖浓度梯度纯化线粒体，不同浓度 蔗糖的缓冲液因比重不同而分层。
3、SDS可以从植物各样组织类型中释放和 结合的细胞核酸。
仪器设备： Apparatus:
研钵和研杵；冷冻离心机；过滤装置（漏 斗，玻棒） pH 计；移液器；水浴箱； 50mL 离心管；2；1.5 mL离心管。 mortar (cold); Centrifuged; filter; pH meter; water bath boiler; 50mL centrifugal tube; eppendorf tube .
5.弃上清，沉淀中加入0.1 mL/g FW 的缓冲液A，离心 管 底 部 再 缓 缓 加 入 0.2 mL/g FW 的 缓 冲 液 B ， 12 000rpm离心20 min，所得沉淀即为纯化的线粒体 Re-suspend the organelle pellet with a soft paintbrus in minimal volume of A buffer (0. 1 mL/g FW), B-buffer were added slowly to the tube bottom making a final concentration 0.2mL/g FW of material again. Collect the organelle pellets by centrifugation, 12,000rpm, for 20 min. Keep the pellet at -20℃ or lyse it at once Keep the pellet at -20℃ or lyse it at once
动物线粒体DNA提取的原理和方法
动物线粒体D NA 提取的原理和方法*X夏玉玲 刘彦群 鲁 成X X (西南农业大学蚕学与生物技术学院农业部蚕桑学重点实验室 重庆 400716)摘 要 从动物线粒体的特征、线粒体的鉴定方法、提取线粒体D NA 各步骤等原理出发,比较了目前常用的几种提取线粒体D N A 的方法,提出动物线粒体D N A 提取的几点关键步骤,并提出一套优化的操作流程。
关键词 线粒体 线粒体D N A 提取方法线粒体是存在于绝大多数真核细胞内的一种基本的重要的细胞器。
它是细胞进行氧化磷酸化的场所。
线粒体基因组不仅是研究D N A 结构与复制转录的良好模型,也是研究真核细胞核酸与蛋白质合成非常合适的模型系统。
线粒体基因组与核基因组的同源基因结构对比也被广泛应用于核基因和核外基因的进化研究中。
由于线粒体基因在真核生物具有高保守性,所以它已成为了研究物种进化的一种常用的标记,并为线粒体起源提供有价值的线索[1]。
动物线粒体D NA 具有分子量小、结构简单、母性遗传和进化速度快等特点,已广泛应用于动物群体遗传学和进化生物学等领域的研究[2]。
进行动物线粒体D NA 方面意义重大,现将线粒体D N A 的提取的原理和方法介绍如下:1 提取动物线粒体D N A 的原理1.1 线粒体的特征线粒体是由内外两层膜组成,外膜光滑,内膜向内回旋折叠,形成许多横隔。
线粒体中含有多种氧化酶,在此进行TCA 循环、呼吸连电子传递和氧化磷酸化等产能作用,并传递和储存所产生的能量,是细胞的动力工厂和生物氧化的主要场所。
线粒体的形状、大小、数目和组成,在不同生物、不同组织以及生活于不同条件下的细胞中变化很大。
线粒体的外型呈多样化,绝大多数类型细胞呈圆形、卵原形,也有呈杆状的。
其体积大小不等,一般直径比较一致,为0.5~1.0L m,长度为1~5L m,最长可达到7L m 。
线粒体的数目与生物种类、组织、细胞类型和细胞生理功能变化有关。
锥虫和有的真菌只有一个线粒体,大多数动物的肝脏细胞含有上千个线粒体,生殖细胞如卵母细胞可达到30万个线粒体,家蚕的每个后部丝腺细胞只有2~4个线粒体[13],而有的细胞根本没有线粒体;在细胞生命活动旺盛时,它的数量多,在衰老时,数量少,有时可能消失;新生细胞比衰老细胞或病变细胞的线粒体多。
线粒体DNA的提取方法
试剂：
Reagent and solution
试剂：
缓冲液A：10 mmol/L T ris-HCL，pH 7.4；500 mmol/L 蔗糖； 20 mmol/LEDTA；0.2%BSA；0.2%β-巯基乙醇 缓冲液B：10 mmol/L T ris-HCL，pH 7.4；600 mmol/L 蔗糖； 20 mmol/L EDTA 裂 解 缓 冲 液 ： 50 mmol/L T ris-HCL ， pH8.0 ； 20 mmol/L EDTA
3. 将沉淀有 mtDNA 的离心管经 12 000rpm 、 4 ℃离心 16 m in， 回收DNA 沉淀， 再用70% 的乙醇漂洗沉淀 1～ 2次，沉淀以室温凉干，溶于适当体积的TE 缓冲液或无 菌去离子水中待用。 3.Centrifuge at 12,000rpm ， 4℃ for 16 min. Wash the DNA pellet with 70% ethanol, dry at room temperature and re-dissolve in TE-buffer.
3、SDS可以从植物各样组织类型中释放和 结合的细胞核酸。
仪器设备： Apparatus:
研钵和研杵；冷冻离心机；过滤装置（漏 斗，玻棒） pH 计；移液器；水浴箱； 50mL 离心管；2；1.5 mL离心管。 mortar (cold); Centrifuged; filter; pH meter; water bath boiler; 50mL centrifugal tube; eppendorf tube .
3.取②中的上清，加入DN ase I 及M gCL 2，使两者的 最终浓度分别为10 μ g/g FW 和10 mmol/L，在4℃下反 应1 h，再加入EDTA 至100 mmol/L，以终止DN ase I 的 反应。 Discard the residue, DNase-1 and MgCL2 were added to the plant material to make a final concentration 10 μg/g FW of material and 10 mmol/L. The DNase-1 treatment done at 4℃ for 1h (or at at 37℃ for 30minutes. Adding EDTA-Na2 to final concentration of 100 mmol/L stopped the raction.
从培养的细胞和组织中分离线粒体的方法和试剂
从培养的细胞和组织中分离线粒体的方法和试剂下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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线粒体的提取与纯化
mt DNA的分离及纯化按戴建华等报道的方法，就具体情况稍加改进，步骤如下（除特别说明，均在4℃下完成）：1.1 取新鲜肝组织，放在缓冲液A（0.25M 蔗糖，0.01M Tris·Hcl，0.001M Na2-EDTA，pH8.0）中漂洗2~3次，尽可能去除表面血污、结缔组织及脂肪组织后剪碎。
按组织重﹕缓冲液A=1﹕5~10加入缓冲液A，用玻璃匀浆器冰浴匀浆。
1.2 1000 g•min-1离心15min；取上清液；15000 g•min-1离心20min，弃上清，沉淀用缓冲液B （0.25M 蔗糖，0.05M Tris·Hcl，0.007M Mg Cl2，p H7.5）洗涤，按0.5m L•g-1肝的比例加入缓冲液B 悬浮沉淀后加入DNase I 至终浓度为100 µg•m L-1，30℃下作用30min。
1.3 冰浴冷却，加入2倍体积的DNase I反应终止液（0.25M蔗糖，0.1M Na2-EDTA，pH8.0）。
15000g•min-1离心20min。
沉淀用DNaseI反应终止液洗涤一次，重复离心。
1.4 按0.5 m L•g-1肝加入缓冲液C（0.1M Nacl，0.05M Tris·Hcl，0.01M Na2-EDTA，p H8.5）悬浮沉淀，加入SDS至终浓度为1%~1.5%，吸打混匀后37℃保温15min。
1.5 用等体积的苯酚，苯酚/氯仿（1:1），氯仿/异戊醇（24:1）各抽提一次。
取水相，加0.2 倍体积1M Na Ac和2倍体积的预冷无水乙醇，混匀后放在4℃冰箱中过夜。
1.6 15000g•min-1离心30min后去上清；沉淀用70%乙醇洗涤2次，干燥，TE（0.01M Tris·Hcl，0.001M Na2-EDTA，pH8.0）溶解。
1.7 加入预处理的RNase I 至终浓度为50µg•m L-1，37℃保温1h。
线粒体DNA的提取方法课件
线粒体DNA与人类健康的关系
疾病关联
线粒体DNA突变可能导致线粒体功能异常，与多种疾病有关，如神经退行性疾 病、代谢性疾病和癌症等。
诊断价值
线粒体DNA突变检测对于某些遗传性疾病的诊断和产前筛查具有重要意义。
01
线粒体DNA提取 方法
酚-氯仿提取法
经典提取方法
酚-氯仿提取法是一种常用的线粒体DNA提取方法，利用酚和氯仿混合物对细胞 进行裂解，释放出线粒体DNA。该方法操作简便，但提取过程中可能会损失线粒 体DNA。
优化自动化提取流程，实现高通量、高效率的线粒体DNA提取，降低人为误差和操 作复杂度。
线粒体DNA与其他细胞器DNA的联合应用
研究线粒体DNA与其他细胞器 DNA（如核DNA、叶绿体 DNA等）的关联性和差异性， 以提供更全面的遗传信息。
开发能够同时提取线粒体DNA 和其他细胞器DNA的方法，以 拓展其在多领域的应用价值。
线粒体DNA的提取 方法课件
THE FIRST LESSON OF THE SCHOOL YEAR
目录CONTENTS
• 线粒体DNA简介 • 线粒体DNA提取方法 • 线粒体DNA提取过程中的注意事
项 • 线粒体DNA提取的应用 • 线粒体DNA提取的未来发展方向
01
线粒体DNA简介
线粒体DNA的结构和功能
在遗传学研究中的应用
遗传疾病研究
线粒体DNA的突变与多种遗传性疾病 有关，通过提取和分析线粒体DNA， 有助于研究这些疾病的病因和发病机 制。
人类进化研究
线粒体DNA作为母系遗传的标志，可 以用来追溯人类的起源和迁徙路线， 对于理解人类进化历史具有重要意义 。
在疾病诊断和治疗中的应用
线粒体DNA提取
mtDNA提取流程（1）将待测组织充分切碎（碎片大小：脾脏组织≤10 mg、其他组织≤25 mg），取样品25 mg移入微型离心管。
（2）加入180 μL Buffer ATL、20 μL Proteinase K、缓慢充分混匀，置于56 ℃恒温水浴直到完全溶解（水浴期间间隔摇晃混合）。
在开始下一步前摇晃混合15 s。
（3）加入200μL Buffer AL，充分混合（血液样品需56℃恒温水浴10 min）。
（4）加入200 μL 无水乙醇，混合均匀。
（5）将混合溶液移至2mL收集管中的滤管里，6000 xg条件离心1 min，取出滤管，扔掉收集管。
（6）将滤管放入新的收集管中，加入500 μL Buffer AW1, 6000 xg条件离心1 min，取出滤管，扔掉收集管。
（7）将滤管放入新的收集管中，加入500 μL Buffer AW2, 20000 xg条件离心3 min，取出滤管，扔掉收集管。
（8）将滤管放入新的微型离心管（1.5-2 mL）。
（9）向滤管中心滴加200 μL（100 μL）Buffer AE洗涤DNA，室温放置1 min。
6000 xg条件离心1 min。
（10）重复一边上述步骤，增大DNA产率（重复一遍即可）。
理论25mg原料大概能提取10-20μg DNA.注：摇晃混合和拿起时一定要轻慢，防止DNA断裂。
琼脂糖电泳步骤1. 准备电泳槽：将有机玻璃的电泳凝胶床洗净晾干，插上样品梳。
2. 琼脂糖凝胶的制备：称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中（1%的琼脂糖含量），置微波炉或沸水浴中加热至完全溶化（不要加热至沸腾），取出摇匀。
3. 灌胶：将冷却60℃的琼脂糖溶液轻轻倒入电泳槽水平板上（厚度不超过0.5cm）。
待琼脂糖胶凝固后，在电泳槽内加入电泳缓冲液，然后拔出梳子。
5. 加样：将DNA样品与加样缓冲液按5：1混匀后（取10µL DNA样液与2µL 电泳载样缓或5µL DNA样液与1µL 电泳载样缓冲液混匀，用移液枪将混合液加到样品槽中，每槽加10-20μL，记录样品的点样次序和加样量。
小麦线粒体基因检测方法
小麦线粒体基因检测方法通常包括以下步骤：
提取线粒体DNA：从小麦样品（如叶片、种子等）中提取线粒体DNA。
可以使用商业化的DNA提取试剂盒来执行此步骤。
PCR扩增：使用聚合酶链式反应（PCR）技术选择适当的引物（针对感兴趣的线粒体基因序列），将提取到的线粒体DNA进行扩增。
这可以通过设计引物特异性地放大目标基因区域。
凝胶电泳分析：将PCR扩增产物加载到琼脂糖凝胶中，然后进行电泳分离。
根据PCR产物的大小，可以确定目标基因是否存在。
DNA测序：如果需要进一步了解线粒体基因的DNA序列，可将PCR产物进行测序。
这将提供更详细的信息，例如碱基序列、遗传变异等。
数据分析和解读：最后，通过对PCR产物和测序结果进行数据分析，在已知的线粒体基因组序列上进行比对，确定目标基因是否存在，以及可能的遗传变异或突变类型。
需要注意的是，具体的小麦线粒体基因检测方法可能会因研究目的和实验室技术水平而有所不同。
因此，在实际操作中，可能需要结合具体的研究要求和实验流程来选择和优化适合的方法。
线粒体呼吸链复合体提取原理
线粒体呼吸链复合体提取原理
线粒体呼吸链复合体提取原理
线粒体呼吸链复合体是由多肽链结构的侧链组成，由具有特定活性的酶分子组成的细胞组织结构。
在细胞内，它们可以负责转化化合物，并促进葡糖的氧化作用，以生成大量的能量。
线粒体呼吸链复合体在细胞应用和研究中发挥着重要作用，其中包括生物化学分析、离子转换、激素分布和细胞活性等。
线粒体呼吸链复合体的提取一般采用不同的方法，包括离心沉淀法、活性柱前处理法和细胞膜沉淀法等。
离心沉淀法是最常用的提取方法，该方法无需添加外源因子，简单高效。
离心沉淀法是将细胞注入抗凝溶液中，接着离心收集沉淀物，最后使用抗凝剂对沉淀物进行洗涤。
活性柱前处理法是通过利用不同酶作用于细胞膜上的特定位点，将特定线粒体呼吸链复合体从膜中析出的一种方法。
该方法用于细胞膜上的酶水解作用，使细胞膜上的线粒体呼吸链复合体从细胞膜中析出，最终可以用于分析及应用研究。
最后，细胞膜沉淀法是用于提取细胞膜上的线粒体呼吸链复合体的一种无需酶预处理的方法。
它的主要原理是利用高温情况下具有自发聚集性的细胞膜蛋白溶解的特性，进行细胞膜的沉淀提取，接着细胞膜中的线粒体呼吸链复合体就可以被提取出来。
因此，线粒体呼吸链复合体的提取原理包括离心沉淀法、活性柱前处理法和细胞膜沉淀法等。
结合各种技术，可以提取出特定线粒体
呼吸链复合体，以支持相关应用研究。
线粒体蛋白提取
线粒体蛋白提取1.线粒体蛋白抽取液配方(pH7.4)：250mM蔗糖，20mM HEPES，10mM KCl,1.5mM MgCl2,1mM EDTA,1mM EGTA,1mM DTT, 17ug/mL PMSF, 8ug/mL aprotinin, 2ug/mL leupeptin；-20℃保存。
2.步骤：（1）收集5X10E7细胞，并用PBS洗细胞；（2）往细胞沉淀加入2mL上述抽取液，并混匀，可以采用超声或匀浆器方法破膜，程度至苔盼兰染色约90%的细胞为蓝色。
（3）750g，4℃离心5分钟，收集上清，此时沉淀即为细胞膜成分。
（4）13000rpm,4℃离心30分钟, 弃上清，此时沉淀即为线粒体成分。
（5）用100uL列解液重悬沉淀，-80℃保存备用.培养悬浮细胞全蛋白裂解的方法1.细胞裂解液（pH8.0）的配方：20mM Tris-Cl，1% NP-40, 137mM NaCl, 20mM DTT,2mM Sodium Vanadate，1ug/mL Aprotinin, 1ug/mL leupetin, 1mM PMSF；配好后分装-20℃保存，其中PMSF和蛋白酶抑制剂量使用时现加。
2.裂解方法：按1X106细胞/100uL的比例加细胞裂解液,混匀后冰浴30分钟, 12,000rpm, 4℃,离心10min, 实验时取25uL的上清加5uL 6X上样缓冲液煮沸5分钟使蛋白变性后，12000rpm离心5分钟，取上清和预染Marker加样电泳。
或-80℃保存备用。
细胞核蛋白质的提取2009-04-28 21:28一、试剂准备缓冲液A 缓冲液B10mmol/L HEPES-KOH pH7.9 20mmol/L HEPES-KOH pH7.91.5mmol/L MgCL2 1.5mmol/L MgCL210mmol/L KCL 420mmol/L NaCL0.5mmol/L DTT 0.2mmol/L EDTA0.2mmol/L PMSF 25% Glycerol0.5mmol/L DTT0.2mmol/L PMSF二、操作步骤1．去细胞培养液，用PBS（含0.05mmol/LPMSF）洗两次，用刮板将细胞刮下，计数细胞，收集于适当体积离心管，用少量PBS冲洗平皿一并吸入离心管。
线粒体分离试方法
线粒体分离试方法线粒体的分离实验方法有多种，以下是其中两种常见的方法：方法一：1.取苗约5克，加三倍体积0.25 mol/L蔗糖-提取缓冲液，在预冷的研钵内快速研磨成匀浆。
2.8层纱布过滤，滤液经3000 g 4℃离心10 min，去除杂质。
3.上清液再用10000 g 4℃离心10 min，沉淀为线粒体。
4.沉淀用2ml 0.25 mol/L蔗糖-提取缓冲液重悬，同上离心一次，弃上清。
5.线粒体沉淀保存用0.3 M甘露醇重新悬浮。
6.吸滴线粒体重悬液于载波片上，再加滴詹纳斯绿染色液，室温下静置染色15 min，用显微镜观察，线粒体呈蓝绿色，小棒状或哑铃状。
方法二：1.将过夜酵母培养物无菌转移到两个15ml离心管中。
2.在4℃下以500g离心10分钟。
3.小心去除上清液，不要干扰沉淀。
4.使用微量移液器在1ml氯化钠（0.9%）中小心冲洗沉淀。
5.使用微量移液器丢弃离心管中的氯化钠。
6.将沉淀重悬于1ml冰冷的裂解缓冲液中，并使用微量移液器充分混合。
7.在4℃的摇床上孵育10分钟。
8.在4℃下以1000g离心10分钟，小心去除上清液。
9.将细胞沉淀重悬于1.5ml冰冷的破碎缓冲液中，并使用针头的钝端完成细胞破碎。
10.将裂解物在4℃下以1000g离心10分钟。
11.将上清液转移到新鲜的15mL管中，并混合从步骤7中获得的上清液。
12.在4℃下以6000g离心10分钟并弃去上清液。
13.用线粒体储存缓冲液清洗颗粒。
14.在4℃下以6000g离心20分钟。
这两种方法的主要步骤包括细胞或组织的匀浆、离心、去除杂质和线粒体的沉淀及重悬等。
在实际操作时，可以根据实验的具体需求和条件选择合适的方法，并严格按照步骤进行操作，以获得高质量的线粒体样本。
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线粒体提取试剂盒
产品组成：
产品组成 BB-3601-1 BB-3601-2
规格 50T 100T
线粒体提取液A 20ml 40ml
线粒体提取液B 20ml 40ml
线粒体保存液 20ml 40ml
产品简介：
本试剂盒可用于各种动物细胞和实体软、硬组织样本的线粒体提取。
不能用于冷冻样品
的线粒体提取。
细胞线粒体提取：
1.取1-2×107个细胞，在4℃，500×g条件下离心2-3分钟，小心吸取培养基，
尽可能吸干，收集细胞；
2.用冷PBS洗涤两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
3.加入400μl冷的试剂A，置冰上10分钟。
4.用Dounce匀浆器匀浆30-40下，然后在4℃，500×g条件下离心5分钟。
5.快速将上清吸入另一预冷的干净离心管。
6.在4℃，11000×g以上条件下离心20分钟。
7.在沉淀中加入400μl冷的试剂B，混匀。
8.在4℃，11000×g以上条件下离心20分钟。
9.弃上清，沉淀用线粒体保存液重悬。
10.即得到线粒体样品，置冰箱备用或直接用于下游实验。
组织线粒体提取：
a)取50-100mg新鲜动物组织样本，用PBS洗涤干净。
b)用剪刀尽可能剪碎，用冷PBS洗涤两次。
c)加入400μl冷的试剂A，置冰上10分钟。
d)用Dounce匀浆器匀浆30-40下，然后在4℃，500×g条件下离心5分钟。
e)快速将上清吸入另一预冷的干净离心管。
f)在4℃，11000×g以上条件下离心20分钟。
g)在沉淀中加入400μl冷的试剂B，混匀。
h)在4℃，11000×g以上条件下离心20分钟。
i)弃上清，沉淀用线粒体保存液重悬。
j)即得到线粒体样品，置冰箱备用或直接用于下游实验。
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