基因工程简答题总结

基因工程原理复习题思考题

5、简单叙述同尾酶和同裂酶的差别。

同尾酶：来源不同，识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端，连接后不能被相关的酶同

时切割。

同裂酶：识别序列相同，切割位点有些相同，有些不同。分完全同裂酶和不完全同裂酶

(PS:完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。

不完全同裂酶：识别位点相同，但切点不同。)

6、连接酶主要有哪些类型？有何异同点？影响连接酶连接效果的因素主要有哪些？类型：DNA连接酶和RNA连接酶

异同点：

相同点：都能以DNA为模板，从5'向3'进行核苷酸或脱氧核苷酸的聚合反应。

不同点：DNA聚合酶识别脱氧核糖核苷酸，在DNA复制中起作用；而RNA聚合酶聚合的是核

糖核苷酸，在转录中起作用。

7、试分析提高平端DNA连接效率的可能方法。(传说中的网上答案)

1、低温下长时间的连接效率比室温下短时间连接的好。

2、在体系中加一点切载体的酶，只要连接后原来的酶切位点消失。这样可避免载体自连，应该可以大大提高平端连接的效率。

3、足够多的载体和插入片段是最重要的。

4、平端的连接对于离子浓度很敏感

5、尽可能缩小连接反应的体积

6、建议放在四度冰箱连接两天效率更高比14度好

8、基因工程中常用的DNA聚合酶主要有哪些？

1) 大肠杆菌DNA聚合酶

2) Klenow fragment

3) T7 DNA聚合酶

4) T4 DNA聚合酶

5) 修饰过的T7 DNA聚合酶

6) 逆转录酶

7) Taq DNA聚合酶

第四章基因克隆的载体系统

1、作为基因工程载体，其应具备哪些条件？

具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性(可转移性) ；

具有合适的筛选标记；

具有较高的外源DNA的载装能力；

具有多克隆位点(MCS ；具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。

3、载体的类型主要有哪些？在基因工程操作中如何选择载体？

基因工程中常用的载体(vector)主要包括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus) 一大类。这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选

的标志基因、单一的限制酶切点等。

4、质粒转化原理，影响转化率的因素有哪些？

A化学法（CaCI2法）转化原理：是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内（感受态细胞）。

B 电穿孔转化转化原理：将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池

中，两极施加高压电场，在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA 重组分子便可进入细胞内。

影响转化率的主要影响因素：

1）载体本身的性质及其空间构象：超螺旋构象转化率最高；

2）插入片段的大小：插入片段越大，转化效率越低；

3）受体细胞的类型及预处理；

4）转化方法：电击法高于化学法。

5、重组体分子的选择方法主要有哪些？并简单阐述其原理。

从总体上看，重组体分子的选择与鉴定方法基本上可以分为如下几个类型：

（1）基于载体遗传标记检测法

在构建基因工程载体系统时，载体DNA分子上通常携带了一定的选择性遗传标记基因，转化或转染宿主细胞后可以使后者呈现出特殊的表型或遗传学特性，据此可进行转化子或重组子

的初步筛选。

（2 ）基于克隆DNA序列检测法

Southern印迹杂交：根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合

在适当的滤膜上，然后通过与已标记的单链DNA探针的杂交作用以检测这些被转移的DNA 片段。

（3）基于外源基因产物检测法

如果目的基因产物能降解某些药物使菌株呈现出抗性标记，或者基因产物与某些药物作用是

显颜色反应，则可根据抗性或颜色直接筛选含目的基因的克隆子。

第五章基因的克隆一般方法

1、基因的克隆方法主要有哪些？并阐述其克隆原理（至少3种，都是书上找的，自选哈，

建议必选DD RT-PCR和SSH原因请看下题）？

1）差减杂交（SH

通过DNA复性动力学原理富集目的基因序列，并以此构建减数文库的方式来进行目的基因分

离克隆的。

2）抑制性差减杂交（SSH

SSH的核心技术是抑制性PCR它是一种将检测子cDNA单链标准化步骤和消减杂交步骤结合为一体的技术。其中标准化步骤均等了检测子中的cDNA单链丰度，而消减杂交步骤去除了

检测子和驱赶子之间的共同序列，使检测子和驱赶子之间不同的序列得到扩增。

3）差异显示PCR（ DD RT-PCR

利用真核生物mRNA吉尾处有POLY（ A）结构，在其3'端设计象5'-T11GA样引物，该引物可与mRNA、数的十二分之一结合，从而使这部分基因得到逆转录，同时结合5'端的随机引物（20条10-mer），可以使不同长度的基因得到扩增。

4）DNA代表性差异分析（DNA RDA

代表性差别分析是通过突变型（驱赶DNA driver DNA与野生型（检测DNA tester DNA

基因组之间的差异来分离和鉴定突变基因的方法。

5）扩增限制性片段长度多样性（AFLP

基因组DNA经过限制性内切酶消化后，产生粘性末端。使用人工合成的短的双链接头，该接

头一端具有同样的内切酶识别粘性末端，互补连接后成为DNA莫板。接头和与接头相邻的酶

切片断的几个碱基序列作为引物的结合位点。

[

2、简单阐述差异显示PCR克隆基因的原理及其优缺点，有何应用？

主要原理：利用真核生物mRNA吉尾处有POLYYA）结构，在其3'端设计象5'-T11GA样引物, 该引物可与mRNA总数的十二分之一结合，从而使这部分基因得到逆转录，同时结合5'端的

随机引物（20条10-mer）,可以使不同长度的基因得到扩增。

优点：

简便、灵敏、高效、省时，能快速显示mRNA勺组成。

所需的mRNA量少。

各样本mRNA勺差异可同时进行比较。

扩出的cDNA可直接用于测序、文库筛选等。

缺点：

假阳性条带多，对低丰度的基因表达不容易检测。

工作量大。

无法定量研究。

扩出的条带往往是3'端比较短的UTR区的一段序列，提供的信息较少。

利用该技术，目前已有越来越多的差别表达基因得以分离和鉴定，在分子生物学和基因工程

研究领域发挥了极大的作用。（P221）

3、抑制性差减杂交的原理与应用。

原理：SSH的核心技术是抑制性PCR它是一种将检测子cDNA单链标准化步骤和消减杂交步骤结合为一体的技术。其中标准化步骤均等了检测子中的cDNA单链丰度，而消减杂交步骤

去除了检测子和驱赶子之间的共同序列，使检测子和驱赶子之间不同的序列得到扩增。

应用：

基因突变体的研究：如基因的表达与不表达；

基因时空表达的研究：如根、茎、叶；

不同处理条件下的基因表达差异：如施肥与不施肥、光照与不光照。

4、酵母双杂交技术、噬菌体表面展示技术的原理。

A. 酵母双杂交技术原理：大部分真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分隔开

的结构域，一个是DNA特异结合域（DNA-binging domain,BD ）, 一个是转录激活域（transcriptional activation domain,AD）。这两个结构域各具功能，互不影响，但一个完

整的、具有激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域，否则无法完成其激活

功能。不同来源的激活因子的BD区与AD区结合后则能特异地激活BD结合基因的表达。

B. 噬菌体表面展示技术原理：当外源D NA片段插入丝状噬菌体基因组的一个外被蛋白基因

中时，如果两者读码框结构保持一致，这个外源DNA片段所编码的产物可与此外被蛋白一起

以融合蛋白的形式表达，并显示在噬菌体的表面。利用抗此外源基因编码产物（多肽或蛋白）的抗体，通过亲和纯化，就能从大量的噬菌体中富集、分离出含有所要的基因的融合噬菌体。

然后，通过基因扩增，得到大量所要的目的基因。