蛋白组分测定

大麦籽粒蛋白质组分含量测定

根据溶解度分类法，大麦籽粒中的蛋白质可分为四类：水溶性蛋白、盐溶性蛋白、醇溶蛋白和碱溶性蛋白。根据其电泳迁移率和氨基酸组成，醇溶蛋白可分为四种，即B 醇溶蛋白、C 醇溶蛋白、D 醇溶蛋白和γ醇溶蛋白。

1．蛋白组分的提取

成熟籽粒在80℃烘箱中烘干至恒重，用样品粉碎机粉碎，过0.5mm 筛。

水溶蛋白：0.5g 样品加10mM Tris-HCl(pH7.5, 10ml)室温下置于连续振荡器上提取2 h ，离心(4000 g)10min ，连续提取两次，将得到的上清液混合保存。

盐溶蛋白：0.5g 样品加5ml 提取液1在室温下置于连续振荡器上提取1 h ，离心(1000 g ≈3900rpm)8min 。

醇溶蛋白：0.5g 样品加1.5ml 提取液2在60℃下置于连续振荡器上提取1 h ，离心(14000 rpm)10min 。

碱溶蛋白：0.2g 样品加10ml0.24％五水合硫酸铜，1.68％KOH ，0.5％酒石酸钾钠和50％(v/v)异丙醇提取显色液在室温下置于连续振荡器上提取1.5 h ，再在60o

C 恒温水浴震荡5min ，离心(4000g)10min ，550nm 比色测定。提取液配置顺序参考后面的双缩脲试剂配制。

2．蛋白组分含量测定

清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白含量利用考马斯亮蓝法以牛白蛋白做标准曲线测定，谷蛋白用Biuret法测定。

清蛋白，球蛋白，醇溶蛋白含量测定(考马斯亮兰法Bradford，1976)：

（一）实验原理

1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。

考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。

在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。

（二）操作方法

染色剂配制：考马斯亮蓝G-250（100mg）溶于50 ml 95%乙醇，加入100ml，85% (w/v)磷酸，稀释至1L。最终浓度为： 0.01% (w/v)考马斯亮蓝G-250, 4.7% (w/v)乙醇, 8.5% (w/v)磷酸。蛋白质含量测定：称取样品蛋白M1（10-100μg）用缓冲液稀释至0.1ml,移至12 x 100 mm 试管。加入5ml以上染色剂。摇匀后 2min-1h 时间内测595 nm波长下的吸光值（3ml比色皿）。空白对照为0.1 ml缓冲液+5 ml染色剂。样品蛋白质含量可以根据其吸光值在标准曲线上定位。

Bradford法的突出优点是：

（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。

（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。

（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。

此法的缺点是：

（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。

（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。

（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。

谷蛋白测定（双缩脲法，Biuret法）

（一）实验原理

双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。

紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris 缓冲液和某些氨基酸等。

此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。

（二）试剂与器材

1. 试剂：

（1）标准蛋白质溶液：用标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。酪蛋白用0．05N NaOH配制。

（2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO4•5H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6•4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。

2. 器材：

可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。

（三）操作方法

1. 标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20~25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。

2、样品的测定：取2~3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。