高效液相色谱法测定胸腺肽_1的含量分析

3 讨论 胸腺肽是胸腺产生的一种具有生物活性的多肽类激素，目
前 国 内 使 用 的 胸 腺 肽 制 剂 都 是 从 小 牛、猪 等 动 物 胸 腺 中 提 取 的［7］。胸腺肽是一 种 用 途 广 泛 且 疗 效 显 著 的 免 疫 增 强 剂。 近 年来，国内外研究证实其组分中 α1 为主要活性成分，胸腺肽α1 含量可以反映该制剂的免疫活性和临床有效性。胸腺肽-α1 最早用于免疫缺 陷 病，以 后 开 始 应 用 于 肿 瘤，作 为 佐 剂 应 用 在 疫苗中，以后再应用于病毒感染中，作为免疫增强剂在美国、意 大利及我国广泛使用，涉及多家公司及各种适 应 症［1］。在 美 国，有关胸腺肽-α1 深入的大型临床三期试验正在进行中［2］。
胸腺肽-α1 是一种 28 个氨基酸的多肽，分子量为 3108． 37。 胸腺肽-α1 应用于临床已有多年历史，有免疫增强作用，主要作 用是提高 T 淋巴细胞功能。可促进机体 T 细胞分化成熟，有利 于增加发育中淋 巴 细 胞 的 抗 凋 亡 能 力，增 加 周 围 淋 巴 细 胞，改 变 T 细胞亚群的比例，刺激 IFN-γ、IL-2、IL-3 的生成，提高 NK 细胞的 活 力，产 生 移 动 抑 制 因 子 ( migration inhibitory factor， MIF) ，使机体免疫系统得以平衡，促进免疫功能的恢复正常，有 利于机体清除病毒，并能直接抑制某些肿瘤的生长［1 － 2］。胸腺 肽-α1 可用于恶性肿瘤患者的免疫治疗，提高化疗或放疗患者 的免疫功能及提 高 治 疗 缓 解 率，延 长 生 存 期，对 机 体 免 疫 抗 肿 瘤及减少治疗并 发 症 有 重 要 作 用［3］。 在 慢 性 乙 型 及 丙 型 肝 炎 治疗中，抗病毒药物联合胸腺肽-α1 转阴率较对照组明显提高， ALT 复常率显示持久的后续效应［4］。国内有报道［5］，对梗阻性 黄疸引起的机体免疫功能低下，胸腺肽有辅助治疗的作用。此 外，在急性重症胰腺炎、感染性休克、H1N1 病毒感染、哮喘发作 都有研究显示胸腺肽-α1 治疗有效［6］。
HPLC 检测是对多肽定性及定量的良好方法［8 － 9］。我们以 日达仙作为标准品，在同样 HPLC 色谱条件及相同样品浓度下 对国产的迈普新、和日及基泰进行测定。结果显示国产的胸腺 肽-α1 纯度大于 99% ，说明我国化学合成多肽经过 HPLC 制备 后的多肽纯度与进口相当，无其他长度的多肽混杂。根据我们 既往对多肽测定的结果，多肽的含量与峰面积呈良好的线性关 系，而不是与峰高线性相关［10］。因此在同样浓度下，以峰面积 作为其含量值，以日达仙作为标样，我们发现国产胸腺肽-α1 的 含量，基泰较高，迈普新次之。国产胸腺肽-α1 效价比远高于日 达仙。对于胸腺肽-α1 的广泛应用来说，国产胸腺肽-α1 更为 合适。
1 材料与方法 1. 1 样品准备 样品购自上海市医药公司，样品编号分别为 1，2，3，4，保 存 于 － 20 ℃ 。样 品 1: 日 达 仙 1． 6 mg，日 本 Sci
作者单位: 200124 上海市浦东新区三林社区卫生服务中心药剂科( 宋卫 华) ; 200030 上海多泰生物工程有限公司( 赵泓)
表 1 不同乙腈梯度标样测试情况
样品 1
乙腈梯度 测定峰值( min)
峰高
峰面积
标样 20μl
0 ～ 80%
14． 57
标样 20μl
20% 3 210． 75
3536． 34 3432． 44
除进口的日本日达仙外，我国有三个品种的国产化学合成胸腺 肽-α1，究竟其纯度及含量是否能同进口的日达仙相当，与疗效 直接相关，是临床医生关心的问题。
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中华全科医学 2011 年 12 月 第 9 卷 第 12 期 Chinese Journal of General Practice，December 2011，Vol. 9，No. 12
·医学检验·
高效液相色谱法测定胸腺肽-α1 的含量分析
宋卫华，赵泓
【摘 要】 目的 建立利用高效液相色谱法测定胸腺肽-α1 含量的探讨分析。方法 色谱柱: C18 柱( φ4． 6 × 250 mm， Agilent，USA) ; 流动相: A: 0． 1% 三氟乙酸; B: 80% 乙腈及 0． 1% 三氟乙酸; 流速: 1． 0 ml / min; 检测波长: 220 nm; 柱温: 室 温; 压力: 15 MPa; 梯度: 乙腈浓度 20% ～ 40% 。进样量为 20 μl。样品浓度 1 mg / ml。高效液相色谱法进行检测。结 果 以日达仙作为标准品，在同样 HPLC 色谱条件及相同样品浓度下对国产的迈普新、和日及基泰进行测定，发现国产 迈普新、和日及基泰纯度高，与日达仙相同纯度均大于 99% 。以峰面积进行样品含量计算，基泰含量高于迈普新及和 日，国产胸腺肽-α1 的效价比远高于日达仙。结论 高效液相色谱法测定胸腺肽-α1 的纯度及含量重现性好，准确度高， 专属性强。 【关键词】 胸腺肽-α1; 高效液相色谱法; 峰面积 【中图分类号】 R446． 6 【文献标识码】 A 【文章编号】 1674-4152( 2011) 12-1954-02
注射用胸腺肽-α1 制剂目前国内市场有日本的日达仙、海 南双成药业有限公司的基泰、成都地奥九泓制药厂的迈普新及 海南中和药业的和日，含量均为每支 1． 6 mg，均为化学合成多 肽的方法生产，国产药物价格仅为进口药物的 20% 左右。为评 价胸腺肽-α1 的纯度及含量，我们对胸腺肽-α1 建立了多肽专 用的高效液相色谱法( HPLC) 分析的方法，可以快速对其纯度 及含量进行评价。
2 结果 标样为样品 1 浓度 1 mg / ml 溶液，进样量为 20 μl，根据不
同的乙腈梯度，HPLC 结果见表 1，我们发现乙腈梯度为 20% ～ 40% 时 HPLC 测定更为敏感。
检查梯度乙腈( 20% ～ 40% ) 时，各样品的 HPLC 测定图 谱: 图 1 为样品 1，图 2 为样品 2，图 3 为样品 3，图 4 为样品 4，
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测定峰值结果见图 5，峰面积结果见图 6。以样品 1 作为标准样 品，样品 2、样品 3 及样品 4 的结构与样品 1 是相同，纯度均大 于 99% ，以峰面积作为其含量值，我们发现胸腺肽-α1 的含量， 样品 4 高于样品 2 高于样品 3。
通讯作者: 宋卫华，电子信箱: weihua － s990420@ 163． com
Clone Pharmaceuticals，注册证号 H20080079，产品批号 PA1059; 样品 2: 迈 普 新 1． 6 mg，成 都 地 奥 九 泓 制 药 厂，国 药 准 字 H20020545，产品批号 100115; 样品 3: 和日 1． 6 mg，海南中和药 业有限公司，国药准字 H20051916，产品批号 20100102; 样品 4: 基泰 1． 6 mg，海南双成药业有限公司，国药准字 H20030407，产 品批号 20100144。 1. 2 样品溶液的 制 备 取 各 样 品 1． 6 mg，精 密 量 取 DDH2 O 1． 6 ml，摇匀，作为 1 mg / ml 药品溶液，每次取样精密吸取 20 μl。 1. 3 HPLC 仪器及试剂 大连依列特 Elite P1201，可变波长检 测器，乙腈和三氟乙酸为美国 Merck 公司分析纯。 1. 4 色 谱 条 件 色 谱 柱: C18 柱 ( φ4． 6 × 250 mm，Agilent， USA) ; 流动相: A: 0． 1% 三氟乙酸; B: 80% 乙腈及 0． 1% 三氟乙 酸; 流速: 1． 0 ml / min; 检测波长: 220 nm; 柱温: 室温; 压力: 15 MPa。进样量为 20 μl。梯度 a: 乙腈浓度 0 ～ 80% ; 梯度 b: 乙腈 浓度 20% ～ 40% 。 1. 5 检测波长的确定 根据多肽药物的特性和我们既往的研 究结果，在分光光度法紫外吸收光谱 220 nm 波长处吸收值最 大，确定 220 nm 为测定波长。 1. 6 检查梯度的确定 取样品 1 浓度 1 mg / ml 溶液作为标准 品，以乙腈( 0 ～ 80% ) 作为梯度，HPLC 峰测定出峰时间、峰高、 峰面积及面积百分比。根据结果计算后继续以乙腈( 20% ～ 40% ) 作为梯度，HPLC 峰测定出峰时间、峰高、峰面积及面积百 分比为。确定乙腈( 20% ～ 40% ) 作为测定梯度。理论塔板数 计算应不低于 3000。
Determination of Thymosin-α1 and Content Analysis by HPLC SONG Wei-hua，ZHAO Hong． Department of Pharmacology， Sanlin Community Health Service Center in Pudong New Area of Shanghai，Shanghai 200124，China 【Abstract】Objective To establish the method of using high-performance liquid chroma-tography( HPLC) to analyze content of thymosin-α1． Methods Chromatographic column: HPLC method was used with a C18 column( φ4． 6 × 250 mm，Ajilent，USA) ; mobile phase: A: 0． 1% trifluoroacetic acid; B: 80% acetonitrile and 0． 1% trifluoroacetic acid; flow rate was 1． 0 ml / min; the detective wavelength: 220 nm; the column temperature was room temp-erature; pressure: 15 MPa; gradient: the concentration of acetonitrile was 20% － 40% ． Incoming sample amounted to 20μl． The concentration of sample was 1 ml / min． Results Zadaxin was tested as standard substance，in the same HPLC chromatographic conditions and the same sample of Maipuxin，Heri and Jitai were determined，all homemade thymosin-α1( Maipuxin，Heri and Jitai) were of high purity． Same with the purity of Zadaxin were larger than 99% ． The content of thymosin-α1 was calculated with peak area． Jitai was the best． Conclusion The method of HPLC was suitable for peptide assay． a repeatable method for the purity and the content of thymosin-α1 were established． 【Key words】 thymosin-α1; HPLC; Peak area