第九章 DNA序列分析

第9章 DNA序列分析
o o o o Maxam—Gilbert化学降解法 Sanger双脱氧链终止法 DNA片段序列测定的策略※ 核苷酸序列的生物信息分析※
9.1 Maxam—Gilbert化学降解法
9.1.1 基本原理
o 1977年，A．M．Maxam和W．Gilbert首先建立了DNA片段 序列的测定方法 o 原理：将待测DNA片段的5‘端磷酸基团作放射性标记， 再分别采用不同的化学方法对特定碱基进行化学修饰并 在该位置打断核酸链，从而产生一系列长度不一且分别 以不同碱基结尾的DNA片段，这些以特定碱基结尾的片 段群通过并列点样（lane-by-lane）的方式用凝胶电泳 进行分离，再经放射自显影，即可读出目的DNA的碱基 序列。 o 核心原理:特定化学试剂可对不同碱基进行特异性修饰 并在被修饰的碱基处（5′或3′）打断磷酸二酯键，从 而达到识别不同碱基种类的目的。
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9.1.2 化学降解测序法的基本步骤
o 化学降解测序法的基本步骤包括： （1）对待测DNA片段的5′端磷酸基团作放射性标记； （2）用化学修饰剂修饰特定碱基； （3）凝胶电泳分离和放射自显影显示出各片段的长度 （4）读序，由于在同一反应体系中，各DNA片段的标 记端相同、起始位点相同，所以，根据断裂部位至 标记端起始部位之间的距离（片段长度），即可得 出碱基顺序。
9.1.3 化学修饰试剂
碱基体系 G A+G C+T C A>C 化学修饰试剂 硫酸二甲酯 哌啶甲酸 肼 肼+NaCl 化学反应 甲基化 脱嘌呤 打开嘧啶环 打开胞嘧啶环
断裂部位 G G和A C和T C
90℃， 断裂反应 A和C NaOH(1.2mol/L） 哌啶（90℃，1mol/L）在修饰位点两端使DNA的糖-磷酸链断裂
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图9-1 MaxamGilbert化学降 解法测序原理
9.1.4 化学降解测序法的应用
o Maxam-Gilbert化学降解测序法不需要进行酶催 化反应，因此不会产生由于酶催化反应而带来 的误差； o 对未经克隆的DNA片段可以直接测序。 o 化学降解测序法特别适用于测定含有如5-甲基 腺嘌呤、G＋C含量较高的DNA片段以及短链的寡 核苷酸片段的序列。 o 测定长度大约250个碱基
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9.2 Sanger双脱氧链终止法
9.2.1 基本原理
p 1977年英国的F．Sanger设计的方法 o 双脱氧核苷酸分子的脱氧核糖的3‘位置的OH缺失，致使下位核苷酸的5‘磷酸基团无 法与之结合。一旦双脱氧核苷酸整合到正 在合成的DNA链中，该股DNA的合成就到此 终止。
图9-2 双脱氧 核苷酸 （ddNTP）分 子结构及DNA 链合成终止反 应 o A．正常 的DNA合 成反应； o B．ddNTP 掺入到 DNA合成 反应后导 致反应终 止
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9.2.2 序列分析的基本步骤 ⒈ 模板制备和引物设计
⑴ 模板制备
o 模板就是待测的DNA片段。模板可以是由M13噬菌体载 体或嗜菌粒载体制备的单链DNA，或双链DNA。无论使 用何种模板，必须保证足够的纯度和浓度，特别是使 用双链DNA模板。
⑵ 引物设计
o 作为测序引物的寡核苷酸。为方便使用，在大多数情 况下可利用通用引物（正向引物）来测序，也可用反 向引物。
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⒉ 经典测序方法的反应步骤
⑴ 模板变性 将待测DNA模板与引物混合，通过加热使模 板变性。 ⑵ 退火 将变性的模板与引物混合物缓慢降温，使引物与 模板结合。 ⑶ 标记 主要有两种方式，其一是在DNA合成过程中掺入 标记的核苷酸，如利用[α-32P]dATP标记。另一种是末 端标记。 ⑷ 延伸和终止 反应体系中新生核苷酸链的合成和随机终 止的过程。 ⑸ 电泳分析和数据读取 将终止反应产物并列点样进行聚 丙烯酰胺凝胶电泳，分辨出大小相差1个核苷酸的反应 产物，然后进行放射自显影。根据片段尾部的双脱氧核 苷酸类型解读出该DNA的碱基排列顺序。
9.2.3 序列分析的工作模式
⒈ 手动测序
o 手动测序（full manual operation）模式就是按 以上经典测序方法进行测序，在PCR技术广泛应用 之前是DNA测序的主导方法。使用该方法工作强度 大，要求工作人员具备娴熟的操作技能。
⒉ PCR测序
o 在手动测序模式中的模板变性、退火、标记、延伸 和终止反应实际上相当于PCR反应的1个循环。因此 可通过类似PCR的热循环反应来完成经典的测序反 应过程，而且还可以重复多次这样的反应（20-25 次）。
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⒊ 全自动测序
o 用4种不同的罗丹明荧光染料分别标记4种双脱氧核 苷酸。由于这4种荧光染料可激发出不同颜色的荧 光，因此4种链终止反应可在同一个试管中进行并 在同一条泳道中检测。 o 将反应产物装入全自动测序仪后，这些产物在聚丙 烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳中按相差1个核苷酸 大小的DNA片段长度顺序向下泳动，当它们到达检 测器时，激光探测仪发出激光，激发荧光染料标记 的4种双脱氧核苷酸，故每一种荧光代表一种碱基。 o 这些荧光信号通过检测系统传输至计算机后，计算 机便能自动排列出DNA片段的碱基序列。
图9-4 ABI377全自动测序过程的荧光信号峰形图 每一种颜色的信号峰代表一种脱氧核苷酸，其排列顺序为 待测DNA的核苷酸序列。
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思考题
1. 简述化学降解法测序的基本原理以及主要应用范围。 2. 简述将Sanger的测序方法称为双脱氧链终止法的理 由。 3. 试述化学降解法和双脱氧链终止法的异同点。
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