凝胶柱层析操作要点
凝胶过滤层析的基本操作
凝胶过滤层析的基本操作凝胶过滤层析（gel filtration chromatography）是一种常用的分离和纯化生物大分子（如蛋白质、核酸等）的方法。
该方法基于分子的大小和形状的差异，利用一种孔隙较小的基质（凝胶）将分子按照大小分离，从而达到纯化的目的。
凝胶过滤层析是一种非亲和层析法，因为分离是通过分子与基质之间的排斥效应进行的，而不是通过特定的信号配对。
1.准备样品：将待纯化的生物大分子样品（如蛋白质溶液）处理成适合进行层析的条件。
这通常包括调节样品的pH值、离子强度、缓冲剂等。
2. 准备层析柱：选择合适的凝胶填料，并根据需要选择合适的柱尺寸。
凝胶填料可以是聚合物凝胶或硅胶凝胶。
聚合物凝胶（如Sephadex、Sepharose等）常用于分离中等分子量的生物大分子，而硅胶凝胶（如Sephacryl等）则适用于分离较大分子量的生物大分子。
3.平衡柱：将层析柱与缓冲液平衡。
通常用适当的缓冲液（如甘氨酸盐缓冲液）进行平衡，以确保柱内填充物的孔隙充满均匀。
4.样品加载：取适量的样品，在不破坏填充物的情况下缓慢地、连续地将样品滴入柱顶端。
加载速度要缓慢，以确保样品充分进入柱内而不是渗漏到填充物外。
5.洗脱：在缓冲液的作用下，样品溶液逐渐沿柱体下滤。
较小的分子会占据填充物内较小的孔隙，因此会与缓冲液一起快速通过填充物，而较大的分子则会在填充物中逐渐滞留。
洗脱时间的长短取决于目标分子的大小。
6.收集洗脱液：用收集管接收洗脱液，以便将目标分子收集起来。
7.考虑后续处理：根据需要，纯化后的生物大分子可以进一步进行其他处理，如浓缩、冻干或储存等。
凝胶过滤层析技术的优点包括操作简单、不需要特殊的设备和试剂、分离过程温和且不破坏生物大分子的活性。
但也需要注意凝胶的选择、控制操作速度、适当调节缓冲液等因素，以获得最佳的纯化效果。
另外，凝胶过滤层析不能对极低分子量的物质进行有效分离，且柱内的适用范围有限，对于较大的生物大分子可能需要较长的时间来完成分离。
凝胶层析_实验报告
一、实验目的1. 了解凝胶层析的原理和操作方法。
2. 掌握凝胶层析分离混合物中不同组分的基本技能。
3. 分析实验结果，验证实验原理。
二、实验原理凝胶层析是一种基于分子筛效应的分离技术。
该技术利用凝胶的孔隙结构，使不同分子量的物质在凝胶柱中受到不同的阻滞作用，从而实现分离。
凝胶是一种具有多孔、网状结构的分子筛，分子量不同的物质通过凝胶柱的速度也不同。
在凝胶层析实验中，样品被注入凝胶柱，随着洗脱液的流动，不同分子量的物质会以不同的速度通过凝胶柱，从而实现分离。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：混合样品、葡聚糖凝胶、洗脱液（如蒸馏水、乙醇等）。
2. 实验仪器：凝胶层析柱、注射器、恒流泵、收集器、滤纸、烧杯等。
四、实验步骤1. 准备凝胶层析柱：将葡聚糖凝胶倒入层析柱，轻轻敲打柱底，使凝胶均匀分布。
2. 洗脱液平衡：将凝胶层析柱放入盛有洗脱液的烧杯中，使凝胶充分浸泡。
3. 样品制备：将混合样品与洗脱液按一定比例混合，制成样品溶液。
4. 注射样品：将样品溶液注入凝胶层析柱。
5. 收集分离组分：随着洗脱液的流动，不同分子量的物质会以不同的速度通过凝胶柱。
将收集器放置在凝胶柱下方，收集分离组分。
6. 分析实验结果：观察收集到的组分，分析实验结果。
五、实验结果与分析1. 分离效果：通过凝胶层析实验，成功分离出混合样品中的不同组分。
2. 分组情况：根据收集到的组分，分析其分子量大小，确定分离效果。
3. 实验原理验证：实验结果表明，凝胶层析能够有效分离混合物中的不同组分，验证了实验原理。
六、实验讨论1. 凝胶层析的原理：凝胶层析的原理是基于分子筛效应，通过凝胶的孔隙结构，使不同分子量的物质在凝胶柱中受到不同的阻滞作用，从而实现分离。
2. 影响分离效果的因素：实验过程中，洗脱液的种类、流速、凝胶的孔径等因素会影响分离效果。
在实验中，应严格控制这些因素，以确保分离效果。
3. 实验结果分析：通过分析实验结果，可以了解不同组分在混合样品中的含量和分子量大小，为后续研究提供数据支持。
柱层析的实验方法和技巧
柱层析的实验方法和技巧柱层析分离技术及其实验技巧一、胶柱层析（正、反相柱层析）——根据物质的极性不同进行分离根据固定相和流动相之间的极性不同，硅胶柱层析可以分为：正相柱层析、反相柱层析。
通常把固定相极性大于流动相极性的柱色谱方法称为正相柱层析，常用的流动相为有机溶剂，如石油醚、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇等。
较适宜分离化合物为低级性、中等极性化合物。
而把固定相极性小于流动相极性的柱色谱方法称为反相柱层析，常用的流动相为甲醇、水等极性溶剂。
较适宜分离极性较高的化合物。
二、凝胶层析——根据物质的分子大小进行分离凝胶层析又称为凝胶过滤、分子筛层析等，是以具有网状结构的凝胶颗粒作为固定相，根据物质的分子大小进行分离的一种层析技术。
常用的凝胶是葡聚糖凝胶（Sephadex)，如Sephadex LH-20。
三、柱层析实验操作3. 1层析柱的选择这与样品的处理量、分离难度、所用的基质和分离目的有关。
以基质是硅胶为例，当样品量较多，分离难度较大（相邻组分的△R较小，相差不到0.1）时，需选用较粗大的柱子以填充较多的硅胶。
柱子长，相应的塔板数就高；柱子粗，上样后样品的原点就小（反映在柱子上就是样品层比较薄），这样相对地减小了分离的难度。
试想如果柱子十厘米，而样品就有两厘米，那么分离的难度可想而知，而如果样品层只有0.5厘米，那么各组分就比较容易得到完全分离了。
当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂，不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么。
如果所需组分和杂质分的比较开（是指在所需组分Rf在0.2～0.4，杂质相差0.1以上），就可以少用硅胶，用小柱子。
3. 2流动相的选择在柱层析分离中流动相（淋洗剂）的选择尤为关键，直接影响到柱层析的分离效果，如果选择不当常常导致几十毫克样品，用了几百毫升淋洗剂都还没有完全分离，甚至不能分离。
以硅胶柱为例，具体选择哪种流动相以及流动相的极性，多是通过薄层色谱（TLC）来确定。
凝胶柱层析操作要点
凝胶柱层析操作要点(一) 基本原理凝胶是一种不带电荷的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，象筛子，直径大于孔径的分子将不能迸入凝胶内部，便直接沿凝胶颗粒的间隙流出，称为全排出。
较小的分子在容纳它的空隙内，自由出入，造成在柱内保留时间长。
这样，较大的分子先被洗脱下来，而较小的分子后被洗脱下来，从而达到相互分离的目的。
洗脱时峰的位置和该物质相对分子质量有直接的定量关系。
在一根凝胶柱中，颗粒间自由空间所含溶液的体积为外水体积V。
不能进入凝胶孔径的那些大分子，当洗脱体积为V。
时，出现洗脱峰。
凝胶颗粒内部孔穴的总体积称为内水体积Vi ，能全部渗入凝胶的那些小分子，当洗脱体积为V。
+ Vi 时出现洗脱峰。
(二)凝胶的类型及性质1.交联葡聚糖凝胶交联葡聚糖凝胶的商品名称为Sephadex，由葡聚糖和3-氯-1.2-环氧丙烷(交联剂)以醚键相互交联而形成具有三维空间多孔网状结构的高分子化合物。
交联葡聚糖凝胶，按其交联度大小分成8种型号(表6–2)。
交联度越大，网状结构越紧密，孔径越小，吸水膨胀就愈小，故只能分离相对分子质量较小的物质;而交联度越小，孔径就越大，吸水膨胀大，则可分离相对分子质量较大的物质。
各种型号是以其吸水量(每g干胶所吸收的水的质量)的10倍命名，如，Sephadex G–25表示该凝胶的吸水量为每g干胶能吸2.5克水。
在SephadexG–25及G–50中分别引入羟丙基基团，即可构成LH型烷基化葡聚糖凝胶。
交联葡聚糖凝胶在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液和有机溶剂中较稳定，但当暴露于强酸或氧化剂溶液中，则易使糖甘键水解断裂。
在中性条件下，交联葡聚糖凝胶悬浮液能耐高温，用120?消毒10分钟而不改变其性质。
如要在室温下长期保存，应加入适量防腐剂，如氯仿、叠氮钠等，以免微生物生长。
交联葡聚糖凝胶由于有羧基基团，故能与分离物质中的电荷基团(如碱性蛋白质)发生吸附作用，但可借助提高洗脱液的离子强度得以克服。
凝胶柱层析操作方法
凝胶柱层析操作方法凝胶柱层析是一种常见的生物化学分离和纯化技术，主要用于分离和纯化蛋白质、核酸、多糖以及其他生物大分子。
它是基于溶液中分子在凝胶柱中通过扩散和吸附/排斥作用的差异，从而实现分离和纯化的过程。
凝胶柱层析的操作步骤如下：1. 准备工作首先，准备好所需的实验设备和试剂，包括凝胶柱、载体溶液、平衡缓冲液、洗脱缓冲液以及待纯化的样品等。
2. 凝胶柱的平衡将凝胶柱放入层析缸中，并用足够的平衡缓冲液预先洗涤凝胶柱，以确保凝胶柱内缸体达到平衡状态。
洗涤凝胶柱的缓冲液通常是与样品一样的成分，以确保样品在平衡和层析过程中的稳定性。
3. 样品的加载将待纯化的样品加入凝胶柱顶部，让样品自由通过凝胶柱，在凝胶柱中发生分子的扩散和吸附/排斥作用，不同组分因差异而逐渐分离。
4. 缓冲液的加入与洗脱根据需要，逐渐加入一定体积的洗脱缓冲液，通过调整洗脱缓冲液的组成和浓度，使目标分子从凝胶柱上洗脱下来。
洗脱过程中，可以利用不同组分在凝胶柱中的吸附/排斥特性来实现分离纯化。
凝胶柱层析的洗脱缓冲液通常是在平衡缓冲液的基础上，通过调整pH值、离子浓度、缓冲剂浓度等参数来实现。
常用的洗脱缓冲液包括梯度洗脱和逐步洗脱等方法。
5. 收集分离纯化的样品通过洗脱，将目标物质从凝胶柱上洗脱下来，可以收集到分离纯化后的样品。
收集的样品可以进行后续的实验分析、储存或进一步纯化。
凝胶柱层析操作中需要注意的事项：1. 凝胶柱的选择根据待纯化样品的性质和分子大小，选择合适的凝胶柱类型和尺寸。
常见的凝胶柱类型包括聚丙烯酰胺凝胶、超大孔凝胶、琼脂糖凝胶等。
2. 缓冲液的选择根据待纯化样品的特性，选择适当的缓冲液，确保样品在平衡、层析和洗脱过程中的稳定性。
常用的缓冲液有Tris-HCl、PBS等。
3. 流速的控制凝胶柱层析过程中，要控制好流速，以避免分子在凝胶柱中过快通过，影响分离效果。
流速的选择应根据试剂和样品的性质进行调节。
4. 洗脱缓冲液的选择需要根据目标分子的特性选择合适的洗脱缓冲液，确保洗脱效果和分离纯化效果的最大化。
凝胶过滤层析如何操作？
凝胶过滤层析如何操作？凝胶过滤层析操作 1.凝胶的预处理交联葡聚糖凝胶的市售商品多为干燥颗粒，使用前必须充分溶胀。
方法是将欲使用的干凝胶缓慢地倾倒入5,10倍的去离子水中，参照相关资料中凝胶溶胀所需时间，进行充分浸泡，然后用倾倒法除去表面悬浮的小颗粒，并减压抽气排除凝胶悬液中的气泡，准备装柱。
在许多情况下，也可采用加热煮沸方法进行凝胶溶胀，此法不仅能加快溶胀速率，而且能除去凝胶中污染的细菌，同时排除气泡。
表凝胶型号和层析柱大小与规格及凝胶用量层析柱规格凝胶的规格和用量(g)直径(cm) 高(cm) 容量 (ml) G25 G50 G100 G200 0.9 15 9.5 2.5 1 0.6 0.3 0.9 30 19 5 2 1.2 0.60.9 60 38 10 4 2.5 1.21.6 20 40 10 42.5 1.21.6 40 80 20 8 5.02.41.6 70 140 35 14 9.0 4.4 1.6 100 200 50 20 12.5 6 2.6 40 210 50 20 12 72.6 70 370 90 35 20 122.6 2.6 100 60 530 1 000 130 250 50 110 30 70 17 352.装柱层析柱的选择一般根据分离样品的种类和样品的数量而定。
纯化蛋白质时，柱床体积应为样品体积的25,100倍。
去除盐及游离荧光素约为样品体积的4,10倍。
柱太短，影响分离效果。
柱长一些，分离效果好，但柱太长，则延长分离时间，样品也稀释过度。
层析柱的内径也要选择适当。
内径过细，会发生“器壁效应”，即靠近管壁的流速要大于中心的流速影响分离效果。
所以层析柱的内径和高度应有一定的比例。
对于除盐来说应为1:5,1:25;对于纯化蛋白质来说应为1:20,1:100。
凝胶柱的装填方法和要求，基本上与离子交换柱的制备相同。
一根理想的凝胶柱要求柱中的填料(凝胶)密度均匀一致，没有空隙和气泡。
sephadexg200柱层析操作方法
sephadexg200柱层析操作方法摘要：一、Sephadex G200柱层析简介二、实验材料与仪器三、操作步骤1.准备样品2.平衡Sephadex G200 柱3.层析操作4.收集分离后的样品5.分析结果四、注意事项五、总结与展望正文：一、Sephadex G200柱层析简介Sephadex G200柱层析是一种常用的分子筛层析技术，基于分子大小和形状的差异来实现样品组分的分离。
Sephadex G200柱是一种葡聚糖凝胶柱，具有较好的分离效果和较高的分辨率。
本篇文章将详细介绍SephadexG200柱层析的操作方法。
二、实验材料与仪器1.实验材料：Sephadex G200柱、样品溶液、磷酸缓冲液、蒸馏水、移液器、试管等。
2.实验仪器：层析柱、层析泵、紫外检测器、移液器、试管架等。
三、操作步骤1.准备样品（1）制备样品溶液：将待分离样品溶解在适当的溶剂中，浓度可根据实验需求调整。
（2）稀释样品：将样品溶液适当稀释，以满足层析柱的进样要求。
2.平衡Sephadex G200柱（1）将Sephadex G200柱连接到层析泵上，加入磷酸缓冲液，进行预洗。
（2）调节层析泵流速，通常为1-2 mL/min。
3.层析操作（1）将稀释后的样品加载到Sephadex G200柱上，启动层析泵，开始进样。
（2）根据样品分离情况，适时调整磷酸缓冲液的流速和浓度。
（3）注意观察紫外检测器信号，了解层析进程。
4.收集分离后的样品（1）层析完成后，关闭层析泵，取出Sephadex G200柱。
（2）将分离后的样品依次收集到试管中，标记试管内容。
5.分析结果（1）对收集的样品进行紫外光谱分析，观察各组分的分离情况。
（2）如有需要，可对样品进行进一步纯化处理。
四、注意事项1.实验过程中要严格控制层析条件，如流速、缓冲液浓度等，以保证分离效果。
2.平衡Sephadex G200柱时，要充分清洗，避免残留杂质影响层析效果。
凝胶层析的操作步骤
凝胶层析的操作步骤嘿，咱今儿个就来唠唠凝胶层析的操作步骤哈！这凝胶层析啊，就好比是一场奇妙的筛选游戏。
首先呢，得把凝胶准备好呀，这就像是给游戏搭好舞台。
要挑那些质量好的、合适的凝胶，可不能随随便便哦。
就好像你要去参加比赛，不得选双合脚的鞋子呀！然后呢，把柱子装好，这柱子就是游戏的通道啦。
得装得稳稳当当的，不能歪七扭八的，不然这游戏可没法好好玩咯。
接下来，就是上样啦。
把要分离的东西小心地加进去，这可得轻点儿、慢点，别把啥都给弄乱了。
这就好像你小心翼翼地把宝贝放进盒子里一样。
上样完了，就开始洗脱啦。
洗脱液就像是推动游戏进行的力量，缓缓地、持续地让各种成分在柱子里跑起来。
想象一下，那些成分就像一个个小选手，在跑道上奔跑呢。
在这个过程中，咱可得时刻留意着。
看看它们跑得多快呀，有没有跑错道呀。
这就跟咱平时做事一样，得时刻盯着，不能马虎。
洗脱的速度也很关键哦，太快了不行，太慢了也不行。
这就像跑步的速度，得恰到好处，才能发挥出最佳效果。
等洗脱结束了，就得收集啦。
把不同的成分分别收集起来，这可不能搞混了呀。
就像你把不同颜色的糖果分别放在不同的小盒子里一样。
整个过程说起来好像挺简单，但实际操作可不能大意哟！每一步都得认真对待，不然结果可就不理想啦。
你想想，要是游戏里你不认真玩，能赢吗？凝胶层析就是这样一个有趣又有点神秘的过程。
它能帮我们把复杂的混合物分离开来，就像变魔术一样。
但这魔术可不是随便就能变成功的，得靠我们的细心和耐心呀。
所以啊，大家在操作凝胶层析的时候，一定要记住这些步骤，一步一步慢慢来，别着急。
相信只要认真去做，肯定能得到满意的结果。
加油吧！让我们在凝胶层析的世界里尽情探索！。
凝胶色谱层析
凝胶色谱层析
凝胶色谱层析（Gel Chromatography）是一种常用的分离和分析
生物大分子的技术。
它基于不同分子的大小和形状差异，通过凝胶的
分子筛效应来实现分离。
凝胶色谱层析通常包括以下步骤：
1. 凝胶的选择：选择适当的凝胶，如琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶，根据待分离物质的大小和性质选择合适的凝胶孔径。
2. 柱子的制备：将凝胶填充到柱子中，确保凝胶均匀且无气泡。
3. 上样：将待分离的混合物加载到柱子的顶部。
4. 洗脱：使用适当的洗脱液，通常是缓冲液，将混合物通过柱子
进行洗脱。
大分子物质由于不能进入凝胶的孔径，会首先被洗脱出来，而小分子物质则会被凝胶保留较长时间。
5. 检测：在洗脱过程中，通过检测柱子出口处的洗脱液，可以监
测不同物质的洗脱时间和浓度。
6. 收集和分析：根据洗脱时间和检测结果，收集不同组分的洗脱液，并进行进一步的分析和鉴定。
凝胶色谱层析的优点包括分离效果好、操作简单、可重复性高，适用于分离和分析蛋白质、核酸、多糖等生物大分子。
它是生物化学、分子生物学和生物技术等领域中常用的分离和分析技术之一。
凝胶过滤层析的基本操作
凝胶过滤层析的基本操作①凝胶介质的选择根据待分离蛋白质的分子量选择具有相应分离范围的凝胶。
对于未知蛋白，应选用分离范围较宽的凝胶，如用Sephacryl S-300。
对于分子量在3~5kDa的蛋白质，脱盐时应选用Sephadex G 50或G 25；而对于小分子量多肽物质（1~5kDa），脱盐则应选用Sephadex G 10或Sephadex G 15。
②凝胶介质的处理和装柱商品凝胶一般是干粉，使用前应用水溶胀。
一般情况下，1份凝胶加十份水，自然溶胀至少24小时。
溶胀后，将上清中细小的凝胶碎块弃除，重新搅拌悬起，待凝胶沉淀后，再次弃去凝胶碎块，重复数次，直到液相澄清为止。
为加速溶胀，可将凝胶煮沸一小时，该法同时具有灭菌的作用。
凝胶过滤层析柱的长与直径的比例应为50~100:1。
装柱时柱体要垂直，先在柱内加入约1/3柱床体积的水或缓冲液，然后沿柱一侧将缓冲液中的凝胶（凝胶：缓冲液=3：1）搅拌均匀，缓慢并连续地一次性注入柱内。
装柱过程中，要避免柱内缓冲液流干，注意保持柱体凝胶均匀无气泡和裂缝。
装完后，可用2 ml蓝色葡聚糖溶液检查柱体的均匀性。
如柱体均匀，可见蓝色区带均匀平稳地通过凝胶，不留任何条纹。
要保持凝胶和缓冲液温度一致，以减少气泡的产生。
③上样凝胶过滤柱层析对于样品的体积有严格的要求。
样品体积不应超过柱床体积的1~5 %，如超过5 %，则会导致分离效率降低，低于1 %则分离效率也不会提高，所以蛋白质样品应尽可能浓缩至10~20 mg/ml。
样品本身对洗脱液的相对粘度不能超过2，样品粘度过高，会使层析区带不稳定，或流速不规律，区带变宽或扭曲。
上样前样品应经0.2 μm 孔径滤膜过滤或10，000 g离心5 min，去除残渣，加样时避免破坏柱体表面，保持其表面均匀平整。
④洗脱洗脱液应保持一定的离子强度以消除凝胶中含有的游离羧基和硫酸根等与蛋白质的结合作用。
Sephadex和Sepharose CL凝胶层析所用的洗脱液的离子强度至少应为0.02 mol/L；Sephacryl凝胶应为0.05 mol/L。
试述柱层析的基本操作过程
试述柱层析的基本操作过程柱层析是一种常用的色谱分离技术，广泛应用于生物、化学、医药等领域。
以下是柱层析的基本操作过程，主要包括以下几个方面：1. 装柱首先，选择适当规格的色谱柱，将其清洗干净并晾干。
然后，在色谱柱中装入适量的吸附剂或凝胶，注意要将其填充均匀，不留气泡。
最后，用柱塞密封色谱柱，以防止样品进入柱体时发生泄漏。
2. 上样将需要分离的样品按规定要求放入色谱柱的上部，然后在适宜的pH和离子强度下进行上样。
上样过程中要注意控制流速，避免样品快速通过色谱柱，导致分离效果不佳。
3. 洗脱通过改变洗脱液的组成和离子强度，选择合适的洗脱液进行洗脱，使目标化合物与吸附剂充分分离。
洗脱过程中要控制好流速，使洗脱液能够充分淋洗柱体中的样品。
通常采用分步洗脱的方式，根据化合物的不同性质，依次选用不同的洗脱液进行洗脱。
4. 收集在洗脱过程中，将洗脱液收集于合适的容器中，并贴上标签，注明时间和条件等信息。
收集的容器通常采用锥形瓶或烧杯等具有良好倾倒性的容器。
5. 检测根据需要，可以采用各种方法对收集到的液体进行检测，判断目标化合物是否成功分离。
常用的检测方法包括紫外-可见光谱法、红外光谱法、质谱法等。
检测过程中要注意对照标准品，确保分离得到的化合物与目标化合物一致。
6. 洗柱为了防止杂质吸附，需要定期更换洗脱液，并进行洗柱操作。
洗柱过程中要注意控制好流速，避免过快导致吸附剂流失。
通常采用逐步降低流速的方式进行洗柱，直到流出液与洗脱液一致为止。
7. 记录记录实验过程中的各种操作和检测信息，以方便实验过程的追溯和整理。
记录的内容包括实验日期、实验人员、色谱柱规格、吸附剂类型、样品名称和来源、上样条件、洗脱液组成和离子强度、流速控制、检测方法等。
这些信息将有助于对实验结果进行分析和总结，提高分离效果和实验效率。
凝胶层析柱装填方法
凝胶层析柱装填方法
宝子，今天来给你唠唠凝胶层析柱的装填方法呀。
凝胶层析柱装填可是个有点小讲究的事儿呢。
咱得先准备好材料，凝胶那肯定是必不可少的啦。
这凝胶就像小魔法粒子一样，在层析柱里发挥大作用。
那开始装填之前，要把层析柱好好清洗一下哦。
就像给它洗个澡，让它干干净净地迎接凝胶的到来。
把柱子垂直固定好，这可重要啦，如果柱子歪歪扭扭的，那后面的实验可就不好搞喽。
接着呢，把适量的凝胶悬浮在合适的溶剂里。
这个溶剂就像是凝胶的小泳池，让凝胶舒舒服服地待在里面。
然后慢慢把凝胶悬液沿着柱子的壁倒入柱子里。
可不能倒得太猛啦，不然凝胶在柱子里就会分布不均匀，就像小朋友排队排得乱七八糟一样可不行。
在倒的过程中呢，可以用个小玻璃棒啥的，沿着柱子壁轻轻搅动一下，这样能让凝胶更好地沉降。
不过要小心哦，别太用力把凝胶都搅坏啦。
凝胶在柱子里慢慢沉降的时候，就像小雪花慢慢飘落堆积起来一样，很是美妙呢。
要是发现凝胶沉降得不太均匀，有一些地方高一些地方低，别慌。
可以小心地再加点凝胶悬液到低的地方，让它慢慢补平。
装填完凝胶之后，可不能马上就用哦。
要让柱子静置一会儿，就像让刚做好的蛋糕放一会儿定型一样。
这样凝胶在柱子里就会更加稳定，在后面进行层析实验的时候就能更好地发挥作用啦。
宝子，凝胶层析柱装填虽然有点小麻烦，但只要按照这些小窍门来做，就不会有太大问题啦。
希望你在做相关实验或者操作的时候顺顺利利的哦。
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凝胶柱层析操作要点
凝胶柱层析操作要点(一) 基本原理凝胶是一种不带电荷的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，象筛子，直径大于孔径的分子将不能迸入凝胶内部，便直接沿凝胶颗粒的间隙流出，称为全排出。
较小的分子在容纳它的空隙内，自由出入，造成在柱内保留时间长。
这样，较大的分子先被洗脱下来，而较小的分子后被洗脱下来，从而达到相互分离的目的。
洗脱时峰的位置和该物质相对分子质量有直接的定量关系。
在一根凝胶柱中，颗粒间自由空间所含溶液的体积为外水体积V。
不能进入凝胶孔径的那些大分子，当洗脱体积为V。
时，出现洗脱峰。
凝胶颗粒内部孔穴的总体积称为内水体积Vi ，能全部渗入凝胶的那些小分子，当洗脱体积为V。
+ Vi 时出现洗脱峰。
(二)凝胶的类型及性质1.交联葡聚糖凝胶交联葡聚糖凝胶的商品名称为Sephadex，由葡聚糖和3-氯-1.2-环氧丙烷(交联剂)以醚键相互交联而形成具有三维空间多孔网状结构的高分子化合物。
交联葡聚糖凝胶，按其交联度大小分成8种型号(表6–2)。
交联度越大，网状结构越紧密，孔径越小，吸水膨胀就愈小，故只能分离相对分子质量较小的物质;而交联度越小，孔径就越大，吸水膨胀大，则可分离相对分子质量较大的物质。
各种型号是以其吸水量(每g干胶所吸收的水的质量)的10倍命名，如，Sephadex G–25表示该凝胶的吸水量为每g干胶能吸2.5克水。
在SephadexG–25及G–50中分别引入羟丙基基团，即可构成LH型烷基化葡聚糖凝胶。
交联葡聚糖凝胶在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液和有机溶剂中较稳定，但当暴露于强酸或氧化剂溶液中，则易使糖甘键水解断裂。
在中性条件下，交联葡聚糖凝胶悬浮液能耐高温，用120?消毒10分钟而不改变其性质。
如要在室温下长期保存，应加入适量防腐剂，如氯仿、叠氮钠等，以免微生物生长。
交联葡聚糖凝胶由于有羧基基团，故能与分离物质中的电荷基团(如碱性蛋白质)发生吸附作用，但可借助提高洗脱液的离子强度得以克服。
凝胶柱层析
G-100 10.0
G-150 15.0
G-200 20.0
1.0
<700
<1500
<5000
150020000
300070000
4000150000
5000300000
5000500000
Sepharose：琼脂糖凝胶 Bio-Gel P：聚丙烯酰胺凝胶分子筛 Sephacryl：用N，N-亚甲双丙烯酰胺交联的葡聚糖凝胶
0<Kd<1
Kd>1
a. b.
c.
d.
优点： 条件温和 b.操作简便 c. 损失少回收率高 d. 层析柱可反复使用
凝胶的类型：
Sephadex: 交联葡聚糖
G-10
吸水量 （g/g干 凝胶） 工作范围 （肽与蛋 白）D
G-15 1.5
G-25 2.5
G-50 5.0
G-75 7.5
部分收集器的操作方法
1．将“手/自”框内的键置于自动状态，按“定”和 “停”;使定时时间为零，放开“停”按“快”或 “慢”(“定”仍按着)至所需的定时时间，放开"慢" 和“定”，再按一下"停"设定定时时间工作就完毕。 若要查看设置时间，则只需按一下“定”键，就能 显示上一次所设时间，若要以秒显示走时时刻，则 需按下“秒”键。
二、原理
凝胶过滤层析也称分子筛层析、分子排阻层析，是
利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分 离物质的分子大小不同来进行分离。
内水体积Vi
外水体积Vo
柱床体积Vt
洗脱体积Ve
Vt=Vo+Vi+Vg
Ve=Vo+KdVi
凝胶柱层析实验报告
1. 理解凝胶柱层析的基本原理和操作步骤。
2. 掌握凝胶柱层析在分离和纯化生物大分子中的应用。
3. 分析实验结果，验证实验原理。
二、实验原理凝胶柱层析是一种常用的分离技术，主要用于分离分子量不同的生物大分子。
其原理是利用凝胶的分子筛效应，将混合物中的大分子、中分子和小分子进行分离。
凝胶是一种具有三维网状结构的物质，其孔径大小不同，大分子无法进入孔径较小的凝胶颗粒，而小分子则可以自由进出。
在实验中，样品溶液通过凝胶柱，不同分子量的物质将在凝胶柱中形成不同的洗脱峰，从而实现分离。
三、实验材料与仪器1. 材料：蛋白质样品、标准分子量蛋白质、凝胶柱、洗脱液、缓冲液等。
2. 仪器：凝胶柱层析仪、离心管、移液器、微量注射器、凝胶柱等。
四、实验步骤1. 准备凝胶柱：将凝胶柱垂直固定在凝胶柱层析仪上，用缓冲液平衡凝胶柱，使其达到稳定的操作状态。
2. 样品制备：将蛋白质样品与缓冲液混合，用移液器取适量样品加入凝胶柱。
3. 洗脱：用洗脱液缓慢洗脱凝胶柱，收集不同洗脱峰的样品。
4. 样品分析：将收集到的洗脱峰样品进行SDS-PAGE电泳分析，观察蛋白质分子量的变化。
五、实验结果与分析1. 凝胶柱层析分离结果：通过凝胶柱层析实验，成功地将蛋白质样品中的大分子、中分子和小分子分离。
洗脱峰1主要包含大分子蛋白质，洗脱峰2主要包含中分子蛋白质，洗脱峰3主要包含小分子蛋白质。
2. SDS-PAGE电泳分析结果：将不同洗脱峰的样品进行SDS-PAGE电泳分析，结果显示洗脱峰1的蛋白质分子量最大，洗脱峰3的蛋白质分子量最小，与凝胶柱层析分离结果一致。
1. 凝胶柱层析是一种有效的分离技术，可以用于分离分子量不同的生物大分子。
2. 通过凝胶柱层析实验，成功地将蛋白质样品中的大分子、中分子和小分子分离，并验证了实验原理。
3. 实验结果表明，凝胶柱层析与SDS-PAGE电泳分析相结合，可以实现对蛋白质分子量的准确测定。
七、实验注意事项1. 在进行凝胶柱层析实验时，应注意凝胶柱的平衡和操作状态，以保证实验结果的准确性。
凝胶过滤层析的基本操作
凝胶过滤层析的基本操作凝胶过滤层析（gel filtration chromatography）是一种广泛应用于生物科学和化学研究中的蛋白质和其他大分子化合物的纯化和分离技术。
它利用凝胶过滤基质，通过分子的大小、形状和电荷等物理性质的差异，将待分离物分离出来。
下面将详细介绍凝胶过滤层析的基本操作步骤。
1.准备工作（1）选择合适的凝胶基质：根据待分离物的分子量范围选择合适的凝胶基质，如分子筛、琼脂糖、琼脂糖-琼脂糖6等。
常用的凝胶基质有不同的孔径大小，可以根据待分离物的分子量范围选择合适的孔径大小。
（2）根据凝胶基质使用说明进行膨胀：将干燥的凝胶基质用适当的缓冲液（如PBS）溶解，并在4°C下放置一段时间使凝胶膨胀成固定的形状。
2.样品处理（1）将待分离物样品稀释至合适的浓度：样品浓度过高可能会导致凝胶基质的饱和和堵塞，因此需要根据实验要求和待分离物的特性合理调整样品的浓度。
（2）加入适当的缓冲液：为了保持待分离物的生物活性和稳定性，需要在样品中加入适当的缓冲液，如PBS、Tris-HCl等。
3.装填柱子（1）将膨胀好的凝胶基质均匀地填充到层析柱中：可以使用手动装填或压力装填的方法将膨胀好的凝胶基质均匀地填充到层析柱中。
填充时需要轻轻振动层析柱，以排除气泡并获得均匀的填充。
（2）用缓冲液预洗柱子：用适当的缓冲液预洗填充好的层析柱，以去除杂质和预平衡凝胶基质。
4.样品加载和洗脱（1）注射样品：将处理好的样品缓慢地注射到已经平衡的层析柱上。
为了保持柱子的稳定性和样品分离的准确性，需要控制好注射的速度和量。
（2）收集分离的组分：将通过凝胶过滤层析分离的组分逐一收集，可以根据样品分离和实验要求，设置适当的收集管。
5.数据分析（1）测定峰值分离量：可以通过对收集的每个分离组分进行浓度测定，然后计算分离量和回收率。
通过浓度测定可以得到每个分离组分的峰值浓度。
（2）分子量估算：可以将已知分子量的标准品（如蛋白质标准品）以及待分离物的峰值分离量和峰值位置进行对比，从而估算待分离物的分子量。
凝胶过滤层析实验报告
凝胶过滤层析实验报告凝胶过滤层析实验报告一、引言凝胶过滤层析是一种常用的生物分离和纯化技术，广泛应用于生物医学研究、生物制药等领域。
本实验旨在通过对凝胶过滤层析的研究，探讨其原理、方法和应用。
二、凝胶过滤层析原理凝胶过滤层析是利用凝胶材料的孔隙结构，通过分子的大小和形状选择性地分离混合物中的组分。
凝胶材料通常是多孔的，具有不同大小的孔隙，通过调整凝胶材料的孔隙大小，可以选择性地分离分子。
三、实验步骤1. 准备凝胶柱：将凝胶材料装入柱中，并将柱与收集容器连接。
2. 样品处理：将待分离的混合物样品处理，去除杂质和大分子。
3. 样品加载：将处理后的样品加载到凝胶柱上。
4. 洗脱：用缓冲液洗脱凝胶柱上的目标分子。
5. 收集：将洗脱液收集于容器中，得到纯化后的目标分子。
四、实验结果与讨论本实验使用了凝胶过滤层析技术对蛋白质混合物进行分离和纯化。
实验结果显示，凝胶过滤层析能够有效地分离目标蛋白质，并具有较高的纯度。
在实验过程中，我们发现凝胶材料的孔隙大小对分离效果有重要影响。
较大的孔隙可以让较大分子通过，而较小的孔隙则只允许较小分子通过。
因此，在选择凝胶材料时，需要根据目标分子的大小来选择合适的凝胶。
此外，凝胶过滤层析还可以用于去除杂质和浓缩目标分子。
在洗脱过程中，通过调整洗脱缓冲液的成分和pH值，可以更好地控制目标分子的洗脱效果。
凝胶过滤层析技术的应用非常广泛。
在生物医学研究中，它常用于蛋白质纯化和分析，可以帮助研究人员获取纯度较高的蛋白质样品，从而进行后续的功能研究。
在生物制药领域，凝胶过滤层析可以用于制备药物和疫苗，提高产品纯度和质量。
然而，凝胶过滤层析也存在一些局限性。
例如，对于较大的分子，凝胶材料的孔隙可能不够大，导致无法通过。
此外，凝胶过滤层析的操作相对较慢，需要较长的时间来完成分离和纯化过程。
综上所述，凝胶过滤层析是一种有效的生物分离和纯化技术，具有广泛的应用前景。
通过对凝胶过滤层析的实验研究，我们深入了解了其原理、方法和应用，并对其优缺点有了更清晰的认识。
凝胶过滤层析实验步骤
凝胶过滤层析实验步骤
凝胶过滤层析实验步骤：
①选取合适粒径交联度的凝胶介质如Sephadex G-25根据分子量范围决定；
②准备柱子前需用大量蒸馏水浸泡凝胶颗粒直至完全膨胀恢复活性；
②装柱时缓缓倾倒凝胶悬浮液沿柱壁旋转使之内层密实无明显气泡夹杂；
④平衡过程中用磷酸盐缓冲液PBS以恒定流速洗涤直至流出液pH值稳定；
⑤样品制备时需离心去除沉淀溶解于少量缓冲液中保证浓度适中；
⑥上样后立即开启蠕动泵控制流速让样品均匀分布避免形成沟道效应；
⑦收集各个分数时预先准备好试管架编号记录每管对应体积位置；
⑧检测分子量分布可通过紫外检测器或其他合适手段监测洗脱峰；
⑨对于感兴趣峰段合并浓缩后可通过SDS-PAGE电泳进一步验证纯度；
⑩实验结束后拆卸清洗层析柱防止残留物质影响下次使用效果；
⑪根据实验目的选择合适分子筛范围重复上述过程直至达到分离目标；
⑫数据分析时注意计算保留时间体积并与标准曲线对比确定各组分分子量。
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(一) 基本原理
凝胶是一种不带电荷的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，象筛子，直径大于孔径的分子将不能迸入凝胶内部，便直接沿凝胶颗粒的间隙流出，称为全排出。
较小的分子在容纳它的空隙内，自由出入，造成在柱内保留时间长。
这样，较大的分子先被洗脱下来，而较小的分子后被洗脱下来，从而达到相互分离的目的。
洗脱时峰的位置和该物质相对分子质量有直接的定量关系。
在一根凝胶柱中，颗粒间自由空间所含溶液的体积为外水体积V。
不能进入凝胶孔径的那些大分子，当洗脱体积为V。
时，出现洗脱峰。
凝胶颗粒内部孔穴的总体积称为内水体积Vi ，能全部渗入凝胶的那些小分子，当洗脱体积为V。
+ Vi 时出现洗脱峰。
（二）凝胶的类型及性质
1.交联葡聚糖凝胶
交联葡聚糖凝胶的商品名称为Sephadex，由葡聚糖和3-氯-1.2-环氧丙烷(交联剂)以醚键相互交联而形成具有三维空间多孔网状结构的高分子化合物。
交联葡聚糖凝胶，按其交联度大小分成8种型号(表6–2)。
交联度越大，网状结构越紧密，孔径越小，吸水膨胀就愈小，故只能分离相对分子质量较小的物质；而交联度越小，孔径就越大，吸水膨胀大，则可分离相对分子质量较大的物质。
各种型号是以其吸水量(每g干胶所吸收的水的质量)的10倍命名，如，Sephadex G–25表示该凝胶的吸水量为每g干胶能吸2.5克水。
在SephadexG–25及G–50中分别引入羟丙基基团，即可构成LH型烷基化葡聚糖凝胶。
交联葡聚糖凝胶在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液和有机溶剂中较稳定，但当暴露于强酸或氧化剂溶液中，则易使糖甘键水解断裂。
在中性条件下，交联葡聚糖凝胶悬浮液能耐高温，用120℃消毒10分钟而不改变其性质。
如要在室温下长期保存，应加入适量防腐剂，如氯仿、叠氮钠等，以免微生物生长。
交联葡聚糖凝胶由于有羧基基团，故能与分离物质中的电荷基团(如碱性蛋白质)发生吸附作用，但可借助提高洗脱液的离子强度得以克服。
因此在进行凝胶层析时，常用含有NaCl的缓冲溶液作洗脱液。
交联葡聚糖凝胶可用于分离蛋白质、核酸、酶、多糖、多肽、氨基酸、抗菌素，也可用于高分子物质样品的脱盐及测定蛋白质的相对分子质量。
（三）操作要点
1.凝胶处理
交联葡聚糖及聚丙烯酰胺凝胶的市售商品多为干燥颗粒，使用前必须充分溶胀。
方法是将欲使用的干凝胶缓慢地倾倒入5～10倍的去离子水中，参照表6–2及其他相关资料中凝胶溶胀所需时间，进行充分浸泡，然后用倾倒法除去表面悬浮的小颗粒，并减压抽气排除凝胶悬液中的气泡，准备装柱。
在许多情况下，也可采用加热煮沸方法进行凝胶溶胀，此法不仅能加快溶胀速率，而且能除去凝胶中污染的细菌，同时排除气泡。
2．凝胶柱制备
合理选择层析柱的长度和直径，是保证分离效果的重要环节。
理想的层析柱的直径与长度之比一般为1:25～1:100。
凝胶柱的装填方法和要求，基本上与离
子交换柱的制备相同。
一根理想的凝胶柱要求柱中的填料(凝胶)密度均匀一致，没有空隙和气泡。
通常新装的凝胶柱用适当的缓冲溶液平衡后，将带色的兰葡聚糖–2000、细胞色素，或血红蛋白等物质配制成质量浓度为2g/L的溶液过柱，观察色带是否均匀下移，以鉴定新装柱的技术质量是否合格，否则，必须重新装填。
3．加样与洗脱
(1)加样量加样量与测定方法和层析柱大小有关。
如果检测方法灵敏度高或柱床体积小，加样量可小；否则，加样量增大。
例如利用凝胶层析分离蛋白质时，若采用28Onm波长测定吸光度，对一根2cm×6Ocm的柱来说，加样量需5mg左右。
一般来说，加样量越少或加样体积越小(样品浓度高)，分辨率越高。
通常样品液的加入量应掌握在凝胶床总体积的5％～10％。
样品体积过大，分离效果不好。
对高分辨率的分子筛层析，样品溶液的体积主要由内水体积(Vi)所决定，故高吸水量凝胶如Sephadex G-200，每mL总床体积可加0.3～0.5mg溶质，使用体积约为0.O2倍总体积；而低吸水量凝胶如Sephadex G–75，每mL总床体积加溶质质量为0.2mg，样品体积为0.Ol倍总体积。
(2)加样方法如同离子交换柱层析一样，凝胶床经平衡后，吸去上层液体，待平衡液下降至床表面时，关闭流出口，用滴管加入样品液，打开流出口，使样品液缓慢渗入凝胶床内。
当样品液面恰与凝胶床表面持平时，小心加入数mL洗脱液冲洗管壁。
然后继续用大量洗脱液洗脱。
(3)洗脱加完样品后，将层析床与洗脱液储瓶、检测仪、分部收集器及记录仪相连，根据被分离物质的性质，预先估计好一个适宜的流速，定量地分部收集流出液，每组分一至数mL。
各组分可用适当的方法进行定性或定量分析。
凝胶柱层析一般都以单一缓冲溶液或盐溶液作为洗脱液，有时甚至可用蒸馏水。
洗脱时用于流速控制的装置最好的是恒流泵。
若无此装置，可用控制操作压的办法进行。
4.凝胶的再生和保存
凝胶层析的载体不会与被分离的物质发生任何作用，因此凝胶柱在层析分离后稍加平衡即可进行下一次的分析操作。
但使用多次后，由于床体积变小，流动速率降低或杂质污染等原因，使分离效果受到影响。
此时对凝胶柱需进行再生处理，其方法是:先用水反复进行逆向冲洗，再用缓冲溶液平衡，即可进行下一次分析。