第三章 分子克隆的载体
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pJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCV
Pel oBAC系列
PCYPAC1
SV40 载体，昆虫 杆状病毒载体
pSVK3质粒，PBV,
Ti质粒
9
第一节 质粒（plasmid）载体
精品课件
10
一、质粒的基本特征
1.质粒的基本概念
质粒是一种独立于染色体外的遗传因子，可自身复 制和表达（但依赖于宿主编码的酶和蛋白质）
不相容群指那些具有不相容性的质粒组成的一个群体，一般 具有相同的复制子。在大肠杆菌中现已发现 30 多个不相 容群，如 ColE1 和 pMB1 ， pSC101 和 p15A。
精品课件
17
A
B
精品课件
18
3）质粒的可转移性transferring
在自然条件下，很多质粒可通过称为细菌接合 （conjugation）的作用转移到新的宿主细胞内。
组成的特殊的群体。
精品课件
5
基因文库gene library
由大量的含有基因组DNA（即某一生物的全部 DNA序列）的不同DNA片段的克隆所构成的群 体，称为基因文库(gene library)
精品课件
6
载体的分类
功能
克隆载体:克隆一个基因或DNA片段 表达载体:用于一个基因的蛋白表达 整合载体:把一个基因插入到染色体 组中
大多数为超螺旋的双链共价闭合环状分子DNA (coverlently closed circle DNA, cccDNA) ,少数 为大线小性为1-200kb，也有更大 常见于原核细菌和真菌中
精品课件
11
一、质粒的基本特征
质粒的表型：抗生素的抗性，产生抗生素、降解复 杂有机化合物、产生毒素（如大肠杆菌素、肠毒 素）、合成限制性内切酶和修饰酶、生物固氮和杀 虫等
精品课件
7
来源： 质粒载体plasmid 噬菌体载体phage 柯斯质粒载体cosmid 真核细胞克隆载体
精品课件
8
载体种类 质粒* λ噬菌体
丝状噬菌体及噬菌粒
载体的种类和特征
受体细胞
结构
插入片断
E.coli E.coli
环状 线状
＜8* 9 - 24kb
E.coli
环状
＜10 kb
粘粒载体
E.coli
作为载体的质粒都含有三种共同的组分： 复制基因（replicator） 选择性记号 克隆位点
精品课件
14
L OC
SC
精品课件
15
2.质粒的基本特征
1）质粒的自主复制性
• 质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复 制
• 质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对 应关系
• 根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质 粒可分为两大复制类型：
在第二个质粒导入后，在不涉及 DNA 限制系统时出现的现 象。质粒的不相容性分子基础，主要是由于它们在复制功 能之间的相互干扰造成的。
不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存 于同一宿主中。两个不相容性质粒在同一个细胞中复制时， 在分配到子细胞的过程中会竞争，随机挑选，微小的差异 最终被放大，从而导致在子细胞中只含有其中一种质粒。
• 松弛型复制控制的质粒 10 - 60 拷贝 relaxed plasmid • 严紧型复制控制的质粒 1 - 3 拷贝 stringent plasmid
精品课件
16
2）质粒的不相容性plasmids incompatibility
是指在没有选择压力的情况下，两种亲源关系密切的不同质 粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。
病毒载体
穿梭载体
E.coli
E.coli
酵母细胞 哺乳类 细胞
动物细胞 动物细胞
和细菌
环状 环状 线性染色体 线性染色体 环状 环精状品课件
≈300 kb
100 - 2000 kb 100 - 2000 kb
＞1000 kb
举例 pUC18/19 , T-载体
pGEM- 3z等 EMBL系列，
λ gt系列 M13mp系列
要素：移动基因 mob ，转移基因 tra ，顺式因子 bom 及其内部的转移缺口位点 nic。
精品课件
19
4）携带特殊的遗传标记
野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记 基因，这是寄主生物产生正常生长非必需的附加 性状，包括：
环状
35- 45kb
BAC (Bacterial Artificial Chromosome)
PAC (P1-derived Artificial chromosome)
YAC (Yeast Artificial chromosome )
MAC (Mammalian Artificial Chromosome)
从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于 在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。
精品课件
源自文库
4
基因克隆
利用重组DNA技术分离目的基因，称为基因 克隆(gene clone)
克隆(clone)
动词：指从单一祖先产生同一的DNA分子群体
或细胞群体的过程。
名词：指从一个共同祖先无性繁殖下来的一群
遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所
精品课件
12
✓ 克隆的质粒载体 允许外源的DNA插入，储存。主要是 DNA水平上的操作。
✓ 基因表达的质粒载体 允许外源DNA的插入、
储存和表达。
精品课件
13
质粒DNA的构型： SC型 共价闭合环形DNA（cccDNA） OC型 开环DNA（（open circular DNA,
ocDNA） L 型 线性DNA（linear DNA,LDNA）
精品课件
3
载体的特征
分子较小，可携带比较大的DNA片段。
能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。
要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制 酶又要最少的切割位点（多克隆位点 multiple cloning sites ，MCS） 。
有合适的选择标记，易于筛选。
有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达， 并且尽可能是高效的表达。
第三章 分子克隆的载体
• 载体的功能及特征 • 质粒（plasmid） • 噬菌体或病毒DNA • 考斯质粒（cosmid）与噬菌粒 • 人造染色体载体
精品课件
1
➢载体的功能及特征
载体的定义
将外源DNA或基因携带入宿主细胞 的工具称为载体(vector)
精品课件
2
载体的功能
• 运送外源基因高效转入受体细胞 • 为外源基因提供复制能力或整合能力 • 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件
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PCYPAC1
SV40 载体，昆虫 杆状病毒载体
pSVK3质粒，PBV,
Ti质粒
9
第一节 质粒（plasmid）载体
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10
一、质粒的基本特征
1.质粒的基本概念
质粒是一种独立于染色体外的遗传因子，可自身复 制和表达（但依赖于宿主编码的酶和蛋白质）
不相容群指那些具有不相容性的质粒组成的一个群体，一般 具有相同的复制子。在大肠杆菌中现已发现 30 多个不相 容群，如 ColE1 和 pMB1 ， pSC101 和 p15A。
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A
B
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3）质粒的可转移性transferring
在自然条件下，很多质粒可通过称为细菌接合 （conjugation）的作用转移到新的宿主细胞内。
组成的特殊的群体。
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5
基因文库gene library
由大量的含有基因组DNA（即某一生物的全部 DNA序列）的不同DNA片段的克隆所构成的群 体，称为基因文库(gene library)
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6
载体的分类
功能
克隆载体:克隆一个基因或DNA片段 表达载体:用于一个基因的蛋白表达 整合载体:把一个基因插入到染色体 组中
大多数为超螺旋的双链共价闭合环状分子DNA (coverlently closed circle DNA, cccDNA) ,少数 为大线小性为1-200kb，也有更大 常见于原核细菌和真菌中
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11
一、质粒的基本特征
质粒的表型：抗生素的抗性，产生抗生素、降解复 杂有机化合物、产生毒素（如大肠杆菌素、肠毒 素）、合成限制性内切酶和修饰酶、生物固氮和杀 虫等
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来源： 质粒载体plasmid 噬菌体载体phage 柯斯质粒载体cosmid 真核细胞克隆载体
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载体种类 质粒* λ噬菌体
丝状噬菌体及噬菌粒
载体的种类和特征
受体细胞
结构
插入片断
E.coli E.coli
环状 线状
＜8* 9 - 24kb
E.coli
环状
＜10 kb
粘粒载体
E.coli
作为载体的质粒都含有三种共同的组分： 复制基因（replicator） 选择性记号 克隆位点
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L OC
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2.质粒的基本特征
1）质粒的自主复制性
• 质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复 制
• 质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对 应关系
• 根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质 粒可分为两大复制类型：
在第二个质粒导入后，在不涉及 DNA 限制系统时出现的现 象。质粒的不相容性分子基础，主要是由于它们在复制功 能之间的相互干扰造成的。
不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存 于同一宿主中。两个不相容性质粒在同一个细胞中复制时， 在分配到子细胞的过程中会竞争，随机挑选，微小的差异 最终被放大，从而导致在子细胞中只含有其中一种质粒。
• 松弛型复制控制的质粒 10 - 60 拷贝 relaxed plasmid • 严紧型复制控制的质粒 1 - 3 拷贝 stringent plasmid
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2）质粒的不相容性plasmids incompatibility
是指在没有选择压力的情况下，两种亲源关系密切的不同质 粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。
病毒载体
穿梭载体
E.coli
E.coli
酵母细胞 哺乳类 细胞
动物细胞 动物细胞
和细菌
环状 环状 线性染色体 线性染色体 环状 环精状品课件
≈300 kb
100 - 2000 kb 100 - 2000 kb
＞1000 kb
举例 pUC18/19 , T-载体
pGEM- 3z等 EMBL系列，
λ gt系列 M13mp系列
要素：移动基因 mob ，转移基因 tra ，顺式因子 bom 及其内部的转移缺口位点 nic。
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4）携带特殊的遗传标记
野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记 基因，这是寄主生物产生正常生长非必需的附加 性状，包括：
环状
35- 45kb
BAC (Bacterial Artificial Chromosome)
PAC (P1-derived Artificial chromosome)
YAC (Yeast Artificial chromosome )
MAC (Mammalian Artificial Chromosome)
从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于 在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。
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源自文库
4
基因克隆
利用重组DNA技术分离目的基因，称为基因 克隆(gene clone)
克隆(clone)
动词：指从单一祖先产生同一的DNA分子群体
或细胞群体的过程。
名词：指从一个共同祖先无性繁殖下来的一群
遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所
精品课件
12
✓ 克隆的质粒载体 允许外源的DNA插入，储存。主要是 DNA水平上的操作。
✓ 基因表达的质粒载体 允许外源DNA的插入、
储存和表达。
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13
质粒DNA的构型： SC型 共价闭合环形DNA（cccDNA） OC型 开环DNA（（open circular DNA,
ocDNA） L 型 线性DNA（linear DNA,LDNA）
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3
载体的特征
分子较小，可携带比较大的DNA片段。
能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。
要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制 酶又要最少的切割位点（多克隆位点 multiple cloning sites ，MCS） 。
有合适的选择标记，易于筛选。
有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达， 并且尽可能是高效的表达。
第三章 分子克隆的载体
• 载体的功能及特征 • 质粒（plasmid） • 噬菌体或病毒DNA • 考斯质粒（cosmid）与噬菌粒 • 人造染色体载体
精品课件
1
➢载体的功能及特征
载体的定义
将外源DNA或基因携带入宿主细胞 的工具称为载体(vector)
精品课件
2
载体的功能
• 运送外源基因高效转入受体细胞 • 为外源基因提供复制能力或整合能力 • 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件