生物大分子相互作用分析新技术

using the same detection system • Detect in real time, measure molecular affinities • Multiplex analysis from a few to a few hundred probes
SPR 角度——扫描曲线
SPR angle
100%
80%
Reflectivity
60%
40%
20%
0% 50 51 52 53 54 55 56 57 58 Angle of incidence
传统检测原理
100%
SPR angle shift as basis of measurement
80%
• Higher density arrays
• Manual spotting—no spotting robot needed
• Small probe volumes
• Higher throughput
• Spotting robot needed
样品无需标记
—particularly valuable for protein biology
Step1 Step2
Direct
B
Indirect
Kinase
C
Intermolecular
FRET应用范围
酵母双杂交系统、噬菌体展示系统所筛选克隆的复证 蛋白质—核酸相互作用
酶活性分析 蛋白酶、磷酸激酶
钙流检测、离子通道研究 蛋白质的结构研究
FRET应用的局限性
信噪比经常不佳，通常为1：1
80%
Reflectivity
60%
40%
Reflectivity change as basis of measurement
D%R
20%
=800nm
Bare Gold +5nm Coating
53 54 55 56 57 58
0% 50 51 52 Angle of incidence
Fixed angle, fixed wavelength
来实时跟踪生物分子间的相互作用，而不用任何标记 物。实验时先将一种生物分子固定在传感器芯片表面， 将与之相互作用的分子溶于溶液流过芯片表面。检测 器能跟踪检测溶液中的分子与芯片表面的分子结合、 解离整个过程的变化。
SPR 现象
450Å gold layer
SPR angle p-Polarized Light 表面等离子共振（SPR）是一种物理现象，当入射光以临界角入射到两种不同折
---背景主要来自受体被直接激发的信号
检测仪器的灵敏度、分辨率以及计算机影像采集和 分析软件的能力
2、表面等离子共振技术（surface
plasmon resonance，SPR）
——适合于多种类型分子并且无需借助标记物可以 实现对复合物直接实时测定的方法
SPRimager®II
基本原理：基于表面等离子共振（SPR）技术
SPRchip™
Monitoring Changes: Difference Images
A
SA+Bi m-PEG n-PEG SA SA Probe Array Probe Array + BiotinT7
B
B
-
A
=
Difference Image: signal due to binding of BiotinT7 to Streptavidin
YFP
Baidu Nhomakorabea
YFP (λ
513nm /
λ
527nm)
CFP (λ433nm /λ476nm)
Wavelength (nm)
FRET技术的优势
均相检测（无分离和洗涤步骤）
实时连续地观察活细胞的动态变化
Ligand
Fluorescence Intensity
Cy5
Cy3
Time
FRET应用的类型
A
生物大分子相互作用分 析新技术
1、荧光共振能量转移技术（fluorescence
resonance energy transfer，FRET）
——能够对于细胞中的蛋白质间相互作用或对作用进 行实时原位分析的检测方法
供体荧光素 素
受体荧光
FRET现象
当一个荧光分子(又称为 供体分子)的荧光光谱与另 一个荧光分子(又称为受体 分子)的激发光谱相重叠时， 供体荧光分子的激发能诱发 受体分子发出荧光，同时供 体荧光分子自身的荧光强度 衰减。FRET 程度与供、受 体分子的空间距离紧密相关， 一般为7～10 nm 时即可发 生FRET；随着距离延长， FRET呈显著减弱.
SPRimager 系统
流动相（含待分析物）
分子探针阵列
Gold-coated glass SPRchip™ 棱镜
p-pol light
Rotating Stage
GWC’s “SPR Imaging” 技术
Bioarray Terminology
Analyte Probe
Biosensor
attachment chemistry gold glass
Add Biotinylated Antibody
SPRimager 系统
优点：分子无需标记；
高通量（蛋白质芯片） 检测对象类型广泛 可实现实时检测 可进行相互作用动力学分析
灵活的阵列形式
SpotReady™, 16 or 25 spots SPRchip™ 1 - 400 spots
• Rapid methods development
Binding
NO Binding
FRET: The Size
实验设计
Cyan light emission
X
Y
CFP
Donor UV laser
Yellow light emission
X
Y
Interaction
YFP
Acceptor
CFP YFP
UV laser
FRET
FRET的能量供体和受体
射率的介质界面（比如玻璃表面的金或银镀层）时，可引起金属自由电子的共振，由于电 子吸收了光能量，从而使反射光在一定角度内大大减弱。其中，使反射光在一定角度内完 全消失的入射角称为SPR角。SPR随表面折射率的变化而变化，而折射率的变化又和结合 在金属表面的生物分子质量成正比。因此可以通过获取生物反应过程中SPR角的动态变化， 得到生物分子之间相互作用的特异性信号。

Protein molecule Protein molecule, labelled • 避免引入标签带来的人为干扰
检测对象广泛、实时并实现高通量
• Study interactions involving Proteins Ligands Peptides Cells Antibodies DNA, RNA Viruses etc.
Reflectivity
60%
40%
20%
=800nm
Bare Gold +5nm Coating
53 54 55 56 57 58
0% 50 51 52 Angle of incidence
SPR imaging 检测原理
100%
SPRimage obtained at this angle
满足条件：
供体受体的激发光谱要分得足够开；
供体的发射光谱与受体的激发光谱要重叠；
供受体的发射光谱要足够分开。
FRET的能量供体和受体
GFP 绿 色 荧 光 蛋 白
CFP (青色荧光蛋白)
(第66位Tyr→Trp)
YFP (黄色荧光蛋白)
(第203位Thr→Tyr)
CFP
Normalized intensity (%)
Monitoring Changes: Image + Chart
Value of Real-Time Monitoring
D%R
12
Antibody > Antigen Biotin > Streptavidin
Ag
SA Con
10 8 6 4 2 0 0 30 60 90 min
Protein Array, End of Experiment End-point measurements miss all the action