多酚氧化酶的分离纯化、蛋白质含量、活性测定及电泳

多酚氧化酶的分离纯化、蛋白质含量、活性测定及电泳

博哥

(中山大学化学与化学工程学院，广州510275)

摘要多酚氧化酶与植物组织培养的酶促褐变以及果蔬品质密切相关。本实验选取蘑菇、茄子、马铃薯为实验材料，提取PPO的粗酶液，再通过考马斯亮兰法法测定蛋白质含量，并采用邻苯二酚、L-多巴为底物，测定PPO活性，最后，进行了聚丙烯酰胺凝胶电泳。结果显示，马铃薯酶液中PPO含量最多为15766 μmol·L-1，其次是蘑菇为13931 μmol·L-1，茄子酶液PPO最少，含量为4061μmol·L-1。但是，以邻苯二酚或多巴为底物时，茄子的比活力最高，蘑菇与马铃薯酶液的比活力相近。聚丙烯酰胺凝胶电泳显示，茄子酶液中存在较多同工酶，蘑菇与马铃薯则较少。

关键词多酚氧化酶考马斯亮兰法聚丙烯酰胺凝胶电泳

1引言

多酚氧化酶(polyphenoloxidase，PPO，EC.1.10.3.1)是植物体内普遍存在的一类铜结合酶。多酚氧化酶的共同特征是能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌。在广义上，多酚氧化酶可分为三大类：单酚单氧化酶(酪氨酸酶tyrosinase,EC.1.14.18.1)、双酚氧化酶(儿茶酚氧化酶catechol oxidse,EC.1.10.3.2)和漆酶(laccase,EC.1.10.3.1)。在这三大类多酚氧化酶中，儿茶酚酶主要分布在植物中，微生物中的多酚氧化酶主要包括漆酶和酪氨酸酶。现在大部分文献所说的多酚氧化酶一般是儿茶酚氧化酶和漆酶的统称。

多酚氧化酶与植物组织培养的酶促褐变以及果蔬品质密切相关。因此，研究多酚氧化酶（酪氨酸酶）的抑制，对防止水果、蔬菜的褐变，化妆品中的皮肤增白，以及因酪氨酸酶催化产生黑色素引起的疾病（黄褐斑等色素沉着性皮肤病等），具有非常重要的治疗意义。

本实验选取蘑菇、茄子、马铃薯为实验材料，通过组织细胞破碎匀浆、过滤、离心、硫酸铵沉淀、透析等步骤获得PPO的粗酶液。再通过考马斯亮兰法法测定蛋白质含量，并采用邻苯二酚、L-多巴为底物，测定PPO活性。最后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的带电性质,以及。

2实验部分

2.1材料与试剂

新鲜蘑菇、茄子和马铃薯购于市场; L-DOPA (L-3- (3, 4-二羟苯基)丙氨酸、邻苯二酚、牛血清白蛋白、硫酸铵、考马斯亮蓝G-250、Tris (羟甲基氨基甲烷)、硫酸铵、氯化钠、0.1 mol/L磷酸

缓冲液pH 6.8(内含20 mmol/L 抗坏血酸)、分离胶缓冲液（pH 8.9）、浓缩胶缓冲液（pH 6.7）、30%丙烯酰胺、10％过硫酸铵、四甲基乙二胺(TEMED)、样品缓冲液、脱色液、Tris-甘氨酸电泳缓冲液（pH 8.3）

2.2实验器械与仪器设备

试管与试管架、烧杯、玻璃搅棒、移液器、滴管等、试剂瓶、1.5 ml离心管、透析袋、过滤纱布、植物组织匀浆器、pH计和pH试纸、低温离心机(德国HETTICH公司、UV-1901紫外可见光分光光度计(北京普析公司)、旋涡混合器、夹芯式垂直电泳槽、电泳仪、恒温水浴

2.3实验方法

2.3.1多酚氧化酶的分离纯化

1．粗酶提取：蘑菇、茄子、马铃薯50g按1：2（W/V）比例与冷的0.1 mol/L磷酸缓冲液pH 6.8(内含20 mmol/L 抗坏血酸)混合，植物组织匀浆器匀浆1-3分钟后，4层纱布过滤，滤液以6500 rpm离心10 min，弃除沉淀获得酶提取液。测量清液体积，留取1 ml用于后面测定蛋白质浓度和活性。

2．盐析：在酶提取液中加入固体硫酸铵使其达到65%饱和度（25°C时，100 ml应加43 g），再以6000 rpm离心20 min，收集沉淀。将沉淀溶解在10-20 ml缓冲液中，用10000 rpm再次离心3-5 min。用于活性测定和电泳分析。

2.3.2考马斯亮兰法测定蛋白质含量

1．取1.5ml离心管16支，分别加入样品、水和试剂，即用1.0 mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别不同剂量，然后用无离子水补充到25 μl。最后各试管中分别加入1.0 ml考马斯亮兰G-250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合。

2．加完试剂2~5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即25μl H2O加1.0 ml G-250试剂。

3．用标准蛋白质量（μg）为横座标，用吸光度值A595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的A595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。

2.3.3 PPO活性测试

采用邻苯二酚、L-多巴为底物，在含有0.94 ml pH 6.8的0.1 mol/L磷酸钾缓冲液离心管中加入10 ml酶液，再加入50 ml的0.025 mol/L邻苯二酚溶液；或者在含有0.82 ml pH6.8的0.1 mol/L磷酸钾缓冲液离心管中加入100 ml酶液，再加入80 ml的0.025 mol/L邻苯二酚溶液，在

紫外可见分光光度计475 nm处测时间扫描值。OD值一般在0.01-0.4/min之内，如果过大，请减少酶液的用量或者将原酶液稀释后再测定。每个样品至少测平行样三次。通过OD值上升的读数变化确定PPO的酶活大小。

2.3.3聚丙烯酰胺凝胶电泳

1．凝胶制备：脂蛋白电泳一般采用分离胶和浓缩胶组成的凝胶板；下层为分离胶，约含7% 丙烯酰胺；上层为样品胶，约含2.5％丙烯酰胺，制备方法按下述进行。

(1)分离胶制备：30％丙烯酰胺溶液5.0 ml；凝胶缓冲液2.5 ml；蒸馏水12.5 ml；TEMED 0.01 ml。置小烧杯中，混匀，再加入10%过硫酸铵溶液0.15 ml，混匀，迅速用滴管分装在二块玻璃板之间，（玻片周围的空隙先用硅橡胶条封住，放入电泳装置中夹紧），凝胶加至红色背景底线处），然后用注射器沿玻板壁小心地在胶面上滴加蒸馏水(约0.5 cm)，使凝胶形成时有一水平面，在室温中放置30 min即可聚合完全。

(2)浓缩胶制备：30％丙烯酰胺溶液1.0 ml，凝胶缓冲液1.25 ml，蒸馏水7.65 ml，TEMED 0.005ml，置小烧杯中，混匀，再加10％过硫酸铵溶液0.1 ml，混匀。将分离胶上层的水倒去，加入配制好的浓缩胶溶液，至红色背景上线处，插入加样梳，放45 min聚合后即可使用，使用前小心拔去加样梳。

2．加样：取实验一中制备的多酚氧化酶样品（蛋白浓度约mg/ml，含量高可稀释，含量低可以多加上样量）30 μl，用30 μl样品缓冲液混合，然后用微量进样器取此混合液10-50 μl加于凝胶的每个凹槽中。

3．电泳：在电泳装置的上、下槽中分别注入Tris-甘氨酸缓冲液，样品端接负极(短玻璃的一边)，电压控制以浓缩胶中100 V，分离胶中180 V电压进行电泳，至距底线1 cm时关闭电源。将电泳后的凝胶取出，置于培养皿中，用蒸馏水冲去残留缓冲液。

4．活性染色：电泳结束后，将其中的一块板至于培养皿中，加入邻苯二酚溶液，使胶完全浸泡其中，由于酪氨酸酶可以催化邻苯二酚形成黑色的邻醌，可以显示出酪氨酸酶的电泳条带，如果有多条，则说明存在着同工酶。

5．考马斯亮蓝染色：将活性染色后的凝胶加入染色液，使将凝胶完全浸泡其中，至凝胶上色后倒出染色液，用蒸馏水冲去残留染色液，加入脱色液，直至背景清晰透明，于凝胶分析仪上成像分析或照相。