细胞质基质与内膜系统2-10-13

三．新蛋白复合物的发现与信号假说的补充
蛋白质转入内质网合成至少涉及5种成分 ①信号肽(signal peptide),是引导新合成肽链转移到内 质网上 的一段多肽,位于新合成肽链的N端,一般16～30个氨基酸残 基,含有6-15个带正电荷的非极性氨基酸,由于信号肽又是
引导肽链进入内质网腔的一段序列,又称开始转移序列
Trypsin
一．信号序列的一般特征及早期信号假说 1. 信号序列的一般特征 长度一般为15～35个氨基酸残基, N-末端含有1个或多个带正电荷的氨基酸,其 后是6～12个连续的疏水残基; 在蛋白质合成中将核糖体引导到内质网,进入 内质网后通常被切除。
二．早期的信号假说
(1)分泌蛋白的合成始于细胞质中的游离核糖体; (2)合成的N-端信号序列露出核糖体后,靠自由碰 撞与内质网膜接触,然后靠N-端信号序列的疏 水性插入内质网的膜; (3)蛋白质继续合成,并以袢环形式穿过内质网的膜; (4)如果合成的是分泌的蛋白,除了信号序列被信号 肽酶切除外,全部进入内质网的腔,若是膜蛋白, 则由一个或多个停止转移信号将蛋白质锚定在 内质网膜上。
(a) 在不含RER小泡的无细胞体 系中翻译分泌蛋白,其N-端有信 号序列,故比从细胞中分泌出来 的相同蛋白质肽链长;
(b)在加有RER小泡的无细胞 体系中翻译分泌蛋白,信号序 列在RER小泡中被切除,得到 的产物与从细胞中合成分泌 的相同。
4.蛋白水解酶水解实验
Mic: Microsome (= ER memb) Trp: trypsin; （胰蛋白酶） Tx: Triton-X 110; Detergent(mb降解)
真核细胞中膜结合核糖体和游离核糖体合成的某些蛋白
结合核糖体 分泌蛋白、肽类激素、生长因子 游离核糖体 可溶性胞质溶胶蛋白
消化酶类、血清蛋白
细胞外基质蛋白 释放到ER腔中的蛋白 RER中的酶类、高尔基复合体的酶 溶酶体的酶、整合膜蛋白 ER膜的糖蛋白、高尔基体的膜糖蛋 白 溶酶体膜糖蛋白、质膜糖蛋白
跨膜蛋白的定位
The membrane-spanning portions of these proteins are usually α-helical regions consisting of 20 to 25 hydrophobic amino acids. The formation of an α helix maximizes hydrogen bonding between the peptide bonds. The hydrophobic amino acid side chains interact with the fatty acid tails of the phospholipids.
Test hypothesis using in vitro cell-free translation system:
3. 信号序列存在的直接证据（Milstein’s experiment） Signal peptide?

Does a leader peptide exist with in vitro translation? Experiment #1: No ER membrane.
糙面内质网上核糖体合成的蛋白类型：Baidu Nhomakorabea
膜整合蛋白(transmembrane protein) 可溶性蛋白
注意：细胞中蛋白质都是在核糖体上合成的，都
是起始于细胞质基质中“游离”核糖体。
一﹑为何分泌性蛋白质的mRNA会特别和附着 于粗内质网上的核糖体结合？
二、核糖体上合成出来的蛋白质如何进入内质网 的膜系而到达内质网的囊腔（cisternae）内部？
Two main pathways Proteins destined for the ER,Golgi, lysosomes, PM and secretion: synthesized on rER Proteins destined for Mitochondria, Chloroplast, Peroxisome,Nucleus: synthesized on ribosome
为什么有些核糖体合成蛋白质时不同内质网结合,有些 正在合成蛋白质的核糖体要同内质网结合,并将合成的 蛋白质插入内质网? 2. Günter Blobel等的建议 ①分泌蛋白的N-端含有一段特别的信 号序列(signal sequence),可将多肽 和核糖体引导到ER膜上; ②多肽通过ER膜上的水性通道进入ER的腔中,并推 测多肽是在合成的同时转移的。
(start transfer sequence)。 ②信号识别颗粒(signal recognition particle,SRP),由6种结构 不同的多肽组成,结合一个7S RNA,分子量325KD,属于一 种核糖核蛋白(ribonucleoprotein)。SRP与信号序列结合,导
致蛋白质合成暂停。
粗面内质网（rough endoplasmic reticulum，rER）
多呈扁囊状,排列较整齐，内质网与核糖体共同
形成的复合机能结构,
主要功能：合成分泌性蛋白和多种膜蛋白
分泌细胞和分泌抗体的浆细胞中的rRE非常发 达，未分化的细胞与肿瘤细胞中较为稀少 移位子（translocon）:新合成多肽进入内质网 有关（Sec61p）
③核糖体附着到内质网上。结合有信号序列的SRP通过它的第三 个结合位点与内质网膜中受体(停靠蛋白)结合, 将核糖体附着到 内质网的蛋白质转运通道(protein-translocating channel) 。 ④SRP释放与蛋白质转运通道的打开。当SRP-信号序列-核糖体 -mRNA复合物锚定到内质网膜后,SRP受体将其结合的GTP水解 同时将SRP释放出来,此时蛋白转运通道打开,核糖体与通道结合, 新生的肽插进通道。释放的SRP又回到胞质溶胶中循环使用。内 质网膜蛋白质转运通道是一个多蛋白的复合物。
（二）ER的功能
ER是细胞内蛋白质与脂类合成的基地，几乎全部
脂类和多种重要蛋白都是在内质网合成的。
rER的功能
sER的功能
rER的功能 主要功能是帮助膜结合核糖体合成的蛋白质转运。 膜结合核糖体上合成的蛋白质与游离核糖体上合成
的蛋白质去向是不同的。
蛋白质合成 蛋白质的修饰与加工 新生肽的折叠与组装
可溶性蛋白质转入内质网合成的过程： 翻译进行到50-70个氨基酸残基，信号肽与SRP结 合→肽链延伸终止→SRP与受体结合→SRP脱离信
号肽→肽链在内质网上继续合成，同时信号肽引导
新生肽链进入内质网腔→信号肽切除→肽链延伸至
终止→翻译体系解散。
四．蛋白质共翻译转运的机理:信号假说 Cotranslational translocation
②信号序列与SRP结合。SRP的信号识别位点识别新生肽的信号 序列并与之结合; 同时,SRP上的翻译暂停结构域同核糖体的 A位点作用, 暂时停止核糖体的蛋白质合成。
nascent protein(初生蛋白, 新生肽) is delivered to the ER (still largely unsynthesized and unfolded)
有20余种与光面内质网不同的蛋白质；
光面内质网（smooth endoplasmic reticulum，sER）
呈分支管状或小泡状，无核糖体附着。 脂质合成的场所 细胞不含纯粹的RER或SER，它们分别是ER连 续结构的一部分。 与高尔基体结构、功能与发生上的关系密切 驱动蛋白与内质网结合 肌肉细胞中的肌质网是一种特化的SER，称为 肌质网，可贮存Ca2+，引起肌肉收缩。

Does a leader peptide exist with in vitro translation? Experiment #2: rER membrane present.
Conclusion: If translation with rER membrane, no leader peptide.
⑤信号序列与通道中受体结合(Sec61 complex )。蛋白质继续
合成,随着SRP的释放,核糖体上的多肽插入到内质网的蛋白通 道之后，信号序列与通道中的受体(或称信号结合蛋白)结合, 蛋白质的合成重新开始,并向内质网腔转运,在此过程不需要 能量驱动。 ⑥信号肽酶切除信号序列。 当转运完成之后,若转运多肽的信号 序列是可切割的序列则被内质网膜中信号肽酶(signal peptidase)所切割,释放出可溶性的成熟蛋白,切下的信号序列 将被降解。 蛋白质合成结束。蛋白转运通道关闭，核糖体与内质网脱离， 进入细胞基质，开始新的蛋白质合成。
必须有极好的运输机制进行分选定位，信号肽 假说。
信号序列的发现和证实（ Signal Hypothesis）
1. 微粒体实验 Colvin Redman 和 David Sabatini用分离的 RER小泡(微粒体)进行无细胞系统的蛋白质合成, 证明了膜结合核糖体上合成的蛋白质进入了微 粒体的腔。
五．膜蛋白的共翻译转运机理
在粗面内质网上合成的蛋白质有两类:
分泌蛋白
膜蛋白
膜蛋白的共翻译转运较为复杂,首先它要靠疏水区 滞留在内质网上,
另外膜蛋白分单次跨膜和多次跨膜；还有膜蛋白 在膜上的定向问题,即羧基端和氨基端位于内质网 膜的内侧(内质网腔面)还是外侧(胞质溶胶一侧), 还是位于同一侧。
脂锚定膜蛋白
(位于质膜的胞质面) 外周蛋白 (质膜的胞质面) 核基因编码的线粒体蛋白 核基因编码的叶绿体蛋白 过氧化物酶体蛋白
核膜糖蛋白、脂锚定质膜蛋白 质膜的外周蛋白(位于质膜的外侧面)
核蛋白
蛋白质合成
内质网上合成的蛋白质主要有：
①向细胞外分泌的蛋白、如抗体、激素； ②膜整合蛋白, ③构成内膜系统细胞器中的可溶性驻留蛋白 需要与其它细胞组合严格分开的酶,如溶酶体的各 种水解酶； ④需要进行修饰的蛋白,如糖蛋白。
由6种结构不同的多肽组成,结合一个7S RNA,分子 SRP与信号序列结合,导致蛋白质合成暂停。
2. 停靠蛋白 (docking protein, DP) ,即SRP在内质网
量325KD,属于一种核糖核蛋白(ribonucleoprotein)。
膜上的受体蛋白,它能够与结合有信号序列的SRP牢
牢地结合,使正在合成蛋白质的核糖体停靠到内质网 上来。
信号假说证明: 基因重组实验（Lingappa的杂合蛋 白研究结果）
(β-lactamase)的信号序列DNA 黑猩猩的α-球蛋白
无细胞的转录和翻译体系+狗组织中分离的ER膜
杂合蛋白出现在ER腔中,而且信号序列被切除 证实了信号假说的正确性 揭示信号序列的重要特性：信号序列没有特异性，并 且原核生物的信号序列在真核生物也是有效的。
Post-translational translocation
Co-translational translocation
信号假说
① ER转运蛋白质合成的起始。通过ER转运的蛋白合成仍然起 始于胞质溶胶中的游离核糖体。核糖体是蛋白质合成的基本 装置，它并不决定合成蛋白质的去向，合成的蛋白质何去何 从，是由mRNA决定的，也就是说是由密码决定的。
一、 内质网的形态结构与功能 内质网(Endoplasmic eticulum,ER):由封闭的管状 或扁平囊状膜系统及其包被的腔形成相互沟通的三 维网络结构。
（一）内质网的两种基本类型
粗面内质网（rough endoplasmic reticulum，rER） 光面内质网（smooth endoplasmic reticulum，sER） 微粒体（microsome）
Blobel 于1972年提出信号序列的建议 1975年正式提出信号假说,揭示了细胞中不同 蛋白质在合成后是如何找到自己的工作岗位的 秘密,发现了蛋白质与生具来的“地址签”。 1999年诺贝尔医学奖。
三．新蛋白复合物的发现与信号假说的补充
1. 信号识别颗粒(signal recognition particle,SRP),
③SRP受体(SPR receptor),是膜的整合蛋白,为异二 聚体蛋白,存在于内质网上,可与SRP特异结合。 ④停止转移序列(stop transfer sequence),肽链上的 一段特殊序列,与内质网膜的亲合力很高,能阻止肽 链继续进入内质网腔,使其成为跨膜蛋白质。
⑤转位因子(translocator),由3-4个Sec61蛋白复合 体构成的一个类似炸面圈的结构,每个Sec61蛋白由 三条肽链组成。