非发酵菌检验程序(详细版)

非发酵菌

是一大群不发酵葡萄糖或仅以氧化形式利用葡萄糖的需氧或兼性厌氧、无芽胞的革兰阴性杆菌；多为条件致病菌。

【氧化酶试验】铜绿、粪产碱为阳性，醋酸钙不动杆菌为阴性

【非发酵菌生化编码管鉴定】

原理：该系列鉴定共有9种生化培养基，共10项试验，参照下述方法，将试验结果换算成4位数字，加以数值化后查表。

例：某一分离菌株，具有下列鉴定结果，数值化后为1734，查表得知：可能为施氏假单胞菌和洋葱单胞菌，再按表中要求做硝酸盐产气补充实验区分。

观察结果时按表中说明进行。

一、O-F试验

接种2支编码管，1支加无菌石蜡油，另1支不加。

原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型；能进行无氧降解的为发酵型；不分解葡萄糖的细菌为产碱型。发酵型细菌无论在有氧或无氧环境中都能分解葡萄糖，而氧化型细菌在无氧环境中则不能分解葡萄糖。本试验又称氧化发酵（O/F或Hugh－Leifson，HL）试验，可用于区别细菌的代谢类型。

培养基均不产酸（颜色不变）为阴性；培养基表面和底部都产酸（变黄）为发酵型；培养基表面变为深蓝色为产碱型；培养基表面变黄、底部不色变为氧化型。

二、硝酸盐还原试验

原理：某些细菌能还原培养基中的硝酸盐，生成亚硝酸盐和氮气等。硝还试验是测定还原过程中生成的亚硝酸盐。如培养基中有亚硝酸盐存在，则亚硝酸盐与醋酸生成亚硝酸，亚硝酸与对氨基苯磺酸生成重氮苯磺酸，后者与α-萘胺结合成N-α-萘胺偶氮苯磺酸。假单胞菌等能使硝酸或亚硝酸盐还原为氮气，此为脱硝化或脱氮化作用。

结果解释：

注意事项：若加入硝酸盐试剂不出现红色，需检查硝酸盐是否已被还原，可于原试管内再加入少许锌粉，如出现红色，表示硝酸盐仍然存在；若不出现红色，表示硝酸盐已衩还原为氨和氮。

【鞭毛染色】

普通染色法一般无法看到鞭毛，要用特殊染色的方法，常采用镀银染色法和鞭毛染色法等，本次实验采用镀银染色法。

方法与原理：在无菌平皿中加10mL左右蒸馏水，用接种环挑一环铜绿假单胞菌，在水面轻轻飘散，可适当研磨，静置10分钟，菌体内部相比蒸馏水为高渗环境，故蒸馏水大量进入菌体，使包括鞭毛在内的菌体胀大，使鞭毛得以被看到。从表面取一环菌液加在洁净玻片上，室温或温箱内烘干，不可火焰固定，加甲液染15分钟，流水下冲洗，加乙液染10分钟，使银均匀附着在需要镀银的菌体上，洗去染液，吸干后油镜观察，可见铜绿假单胞菌为单鞭毛，变形杆菌为周鞭毛。

【其他试验】

一、铜绿假单胞菌

1、培养特点及菌落特征：在普通琼脂平板上形成圆形、大小不一、边缘不整齐、扁平、光滑、湿润而常呈融合状态的菌落，并产生特征性的蓝绿色水溶性绿脓素和黄绿色青脓素，血平板上形成大而扁平，湿润，边缘不齐，有金属光泽，有生姜气味的灰绿色菌落，并形成透明溶血环。SS平板上形成类似沙门菌的乳糖不发酵菌落，较浑浊，48h后菌落中央也呈绿色。MAC平板上可形成微小、半透

明菌落，48h后菌落中央常呈绿色。其最适生长温度35℃，4℃不生长，42℃可生长。

2、形态观察：为革兰阴性杆菌，菌体长短不一，常呈多形性；不染色标本的动力观察：运动活跃；鞭毛染色，一端有1~3根鞭毛。

95%以上的铜绿假单胞菌可通过观察以下几个特征而得到鉴定：氧化酶阳性（10秒内）。菌落较大，生姜样气味。绿脓素产生。少数铜绿假单胞菌可产生其他颜色色素，如红脓素（红色），黑脓素（棕色到黑色），青脓素（黄色）。

注意事项：从临床分离的菌株中有部分不产色素（约占10%），尤其是从痰液中分离的菌落为粘液型的铜绿假单胞菌，常不产生色素，但在室温中移种数代后可恢复典型菌落和产色素能力。对于这些不产色素的铜绿假单胞菌，可通过硝还试验，或产生氮气，42℃生长以及在含20.g/L的硫酸镉琼脂生长加以确定。

二、粪产碱杆菌

1、菌落观察：在血平板上形成灰色、扁平、较大、边缘薄、不整齐的菌落，不溶血，有水果味，并在菌落下方的血琼脂上呈明显的绿色；在SS和MAC平板上形成无色透明或淡黄色的乳糖不发酵型菌落，有少数菌株在SS平板上不生长。

2、形态观察：为革兰阴性球杆菌，常单个存在，鞭毛染色为周鞭毛。

三、醋酸钙不动杆菌

1、菌落观察：在血平板上形成圆形、凸起光滑、边缘整齐、不透明、灰白色、有粘性的菌落，多数菌株不溶血；其菌落较大，直径约2~3 mm，在SS平板上仅少数菌株生长；在MAC平板上可形成淡黄色菌落。

非发酵菌鉴定程序

粪便标本其他标本

接种选择性培养基（SS，麦康凯，伊红美蓝）接种血平板

35℃24小时

挑取可疑菌落（SS上非红色菌）

G-杆菌或弧菌G-杆菌或球杆菌形态

氧化酶（+）

氧化酶（-）

杆菌形态杆菌或弧菌

葡萄糖氧化，不发酵葡萄糖氧化发酵

（KIA，MIU，IMVpC，苯丙氨酸）非发酵菌科弧菌科肠杆菌科初步鉴定，作血清凝集

最终结果

非发酵菌生化反应（微量反应管）

最终结果