免疫组化及特殊染色

Synaptophysi n 测定 Synaptophysi n所有肿瘤细 胞中都显示出 较强的阳性表 达，而在肿瘤 细胞中包绕的 肠腺体呈阴性 诊断:神经内 分泌癌


组织切片的预处理（枸橼酸钠缓冲液中热修复，酶消化—暴露出 抗原决定簇），TBS漂洗
内源性过氧化物酶的阻断 一抗孵育，TBS漂洗 二抗孵育，TBS漂洗

DAB显色，蒸馏水中止反应
苏木素复染及封片
切片
烤片
脱蜡水化
H2O2处理
热修复
一抗
二抗 Enlivision试剂
DAB显色
苏木素复染
细胞浆纤维状阳性--中间丝或微丝
中间丝;CK;Vimentin;Desmin GFAP（glial fibrillary acidic protein ， 胶质纤维酸性蛋白 ） NF（Neurofilament，神经元胞浆——节细胞 神经瘤，副节瘤/嗜铬细胞瘤，神经母细胞 瘤） Nestin：巢蛋白，神经前体细胞
⑤ 研究某些癌症与病毒的关系，如肝癌与乙 型肝炎病毒、鼻咽癌与EB病毒、宫颈癌与 乳头状瘤病毒等的关系；
⑥ 为肿瘤治疗的选择提供依据，如乳腺 癌检测雌、孕激素受体（ER、PR）呈阳 性时，应用他莫昔芬（三苯氧胺）治疗 可预期获得较好的疗效； ⑦ 检测癌基因和抑癌基因蛋白产物（如 c-erbB2，p53）、增生活性抗原（如 Ki-67，PCNA）用来估计肿瘤的预后。
弥漫或片状的细胞浆阳性





蛋白分布在细胞内液、大量的微囊及内质 网中 如:myoglobin、hemoglobin、albumin、 AFP、 NSE、cytoplasmic Ig、CD3 病毒颗粒/蛋白 如:HBsAg（常在核旁着色） 从细胞间液吸收的蛋白 如: Ig、 albumin
Endocrine granule Mitochondoria Lysosome
amylase cytochrome lysozome P-450 PAcP
DNA polymerase keratin in keratin in S-100 S-100 (occasional) carcinoid, NSE adenocarcinoma prefixation estrogen receptor mesothelioma hepatocyte diffusion vimentin actin artifact

抗原是指能够刺激机体产生（特异性） 免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和 致敏淋巴细胞在体内外结合，发生免疫 效应（特异性反应）的物质。抗原的基 本特性有两种，一是诱导免疫应答的能 力，也就是免疫原性，二是与免疫应答 的产物发生反应，也就是抗原性
与人类有关的抗原




病原微生物 在医疗中将病原微生物制成疫苗进行 预防接种，可以提高人的免疫力。 嗜异性抗原 一类与种属特异性无关的、存在于人 以及某些动物、植物、微生物的性质相同的抗原。 肿瘤抗原 由物理的、化学的因素或某些病毒诱发 的实验动物肿瘤，其细胞中或细胞表面均出现特异性 抗原，称为肿瘤特异性抗原。已证实在某些人类肿瘤 中心存在着与病毒密切相关的抗原。 同种异体抗原 动物免疫血清
细胞核阳性


细胞周期素蛋白：cyclins、cyclin 依赖激 酶(cdk)、cdk 抑制剂 (如 p16)等 细胞增殖相关蛋白：Ki67、PCNA 转录因子：MyoD1、myogenin、TTF-1、CDX2、 PAX5 肿瘤抑制基因：如 p53、p63、Rb、WT1 基因错配产物：如 MLH1、MSH2
标记物
它借助于荧光素、酶等标记抗体 与组织切片或细胞涂片中相关抗原相 结合，由于荧光素所发荧光可用荧光 显微镜检出，而酶可经一定的显色处 理，呈现醒目的阳性色彩，从而可准 确定位欲测定的抗原物质。
荧光素、酶
标 记
组织抗原 抗体 酶 荧光素
抗 体 抗 原
荧 光 阳性色彩
显微镜观察
三大系统 本技术是应用免疫学原理 来识别待测抗原，再通过酶和底物 的作用外加显色剂，将上述反应显 示出来。
（三）免疫组化的应用
① 分化差恶性肿瘤的诊断和鉴别诊断； ② 证实内分泌肿瘤和神经内分泌肿瘤； ③ 应用肿瘤胚胎性抗原诊断某些肿瘤，如癌 胚抗原（CEA）对胃肠道癌、甲胎蛋白（AFP） 对肝癌和卵巢内胚窦癌诊断有帮助；
④ 有时可帮助确定肿瘤的良恶性，如应用免 疫球蛋白轻链κ和λ来鉴别滤泡性恶性淋 巴瘤和滤泡性反应性增生；
识别系统
免疫组 织化学
联结系统
显示系统

识别系统是指特异性抗体识别组织 或细胞中的靶抗原。抗原抗体的特 异性结合是本技术的基本依据。

联结系统由联结抗体构成。它的作 用是联接识别系统和显示系统。

显示系统的目的是使抗原抗体间的 特异性结合变为肉眼可见。因此显 示系统由标记酶，底物和显色剂组 成，以在靶抗原存在位点上形成有 色沉淀。
胰腺，insulin
平滑肌肉瘤，SMA
假 阴 性
蛋 白 酶 未 处 理
蛋 白 酶 处 理 后
微 波 未 处 理
微 波 处 理 后
皮肤，IV胶原
甲状旁腺，PTH
II.
染色的特异性判定
Apical membrane
Basolateral membrane
各 抗 原 在 细 胞 内 的 显 色 方 式
免疫组织化学技术 Immunohistochemistry techniques
第一节 免疫组织化学 技术概述
（一）发展简史



1941年Coons首先用荧光素标记抗体检测 肺组织内的肺炎双球菌获得成功。 60年代Nakane建立酶标抗体技术运用铁 蛋白标记Ab技术 70 、80年代多位科学家改良上述技术， 建立辣根过氧化物酶--抗过氧化物酶 （PAP）技术,抗生物素—生物素（ABC） 法使免疫组织化学进入了应用阶段。

溶酶体颗粒：如 lysozyme、CD68、myeloperoxidase 黑色素小体和前黑色素小体：如 HMB45、Melan-A 细胞毒颗粒：如TIA-1、granzyme B 线粒体: 如抗线粒体抗体, HEP-PAR1 神经内分泌颗粒：各种激素（如PTH、 ACTH、 insulin）、CgA、Syn W-P 小体: F-VIII相关抗原 分泌颗粒：如BRST-2、surfactant、PSA 细胞内微生物：如弓形虫

细胞核酶：如 TdT 类固醇激素受体：如 ER、PR、AR
细胞核钙结合蛋白：如 S100蛋白、calretinin
定位细胞核的病毒：如 CMV、HBcAg（核+核周）

NeuN：neuronal nuclei，表达于成熟的神经元
细胞浆内颗粒状阳性--定位于细胞器





抗体（antibody）指机体的免疫系统在 抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增 殖分化成的浆细胞所产生的、可与相应 抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。
世界著名抗体公司


Santa公司、Abcam公司、 Abgent公司、Proteintech Group、 Cell Signaling Technology（CST）、 罗氏公司（Roche）
特点： 特异性强 灵敏度高 定位准确和简便快速等优点 又能够将形态、功能及代谢的研 究有机结合起来。
IHC方法
1 过去用过的方法——ABC法，SP法。——三步 法，使用生物素 2 目前最常用的方法——二步法： EnliVision 显色系统（即用型非生物素免疫组化 EnliVisionTM plus检测试剂盒 ） 将多个抗鼠和抗兔的IgG分子二抗与辣根过氧 化物酶通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个大 分子多聚体（polymer），直接放大信号40-50 倍。 敏感、省时、方便、背景低（避免了内源性生 物素干扰）。
IHC染色结果的判读原则
I. 注意影响IHC结果判读的因素
未 阻 止 内 源 性 过 氧 化 物 酶 阻 止 内 源 性 过 氧 化 物 酶 后
假 பைடு நூலகம் 性
玻片干燥造成的“边缘效应”
石 蜡 切 片
冰 冻 切 片
假阴性：注意内对照
结肠，CEA 酒 精 固 定 福 尔 马 林 固 定 气 泡 影 响 抗 体 抗 体 反 应

2000年以后各种免疫组化技术更加成熟, 使免疫组化技术成为当今生物医学中形 态、功能代谢综合研究的一项有力工具。 其应用范围深达医学各个学科，是目前 生命科学工作者应该掌握的基本技术之 一。
（二）免疫组织化学的原理
定义:是应用免疫学基本原理—抗原抗体反应，即抗原与抗体 特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光 素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原（多 肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫 组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技 术(immunocytochemistry)。 将试剂抗原或试剂抗体用可以微量检测的标记物进行标记， 在与标本中的相应抗体或抗原反应后，可以不必测定抗原抗体 复合物本身，而测定复合物中的标记物，通过标记物的放大作 用，进一步提高了免疫技术的敏感性。
Plasma Membrane + PER・Golgi
Plasma membrane
PER + Golgi
Golgi apparatus
Endocrine granule
CEA EMA ALP CD10
SC EGFR E-cad
Leu 4 Leu 1 HLA-DR LCA CEA, EMA, PALP in SC, CA19-9 seminoma in cancer cell cell Cerb-B2 Cytosol Nucleus
免疫组化在临床诊断中 应用病例示范（Case 1）

临床病史资料：48岁，男性，胃活检标
本取自胃大弯部位。H&E染色切片描述肿 瘤细胞显示在间质中呈癌巢样，邻近的 腺体肠上皮化生，间质中的不规则的巢 状结构待诊断.

H&E染色

首先选择Cytokeratin单克隆广谱角蛋白抗体在 细胞巢中呈强阳性染色，证明是上皮来源性的 肿瘤，在图片顶部是非肿瘤性的腺上皮阳性， 肿瘤性的腺体在底部。
immunogloblin SC, AFP chromogranin A AFP EMA, serotonin HCG immunoglobulin Peptide hormone factor Ⅷ-RA in special prolactin in conditions activated pituicyte Cytoskeleto n
IHC方法
3 最新一代的免疫组化 Novolink Polymer法： 使用小分子聚合物（减少细胞薄膜硬脂的阻碍， 比传统中的大分子聚合物染色更显著），信号 放大更强，还可以检测到组织中低浓度的抗原。
IHC技术的基本操作流程
EnliVision法的工作程序：
切片，烤片，脱蜡水化（使用防脱片处理的玻片：多聚赖氨酸， APES） H2O2处理（—阻断内源性过氧化物酶），蒸馏水漂洗

肿瘤细胞再进一步进行cytokeratin 7 /cytokeratin 20染色，染色证实在肿瘤 细胞中同时缺少cytokeratin 7 /cytokeratin 20的表达。在这张图片中肠上皮 细胞cytokeratin 20阳性与邻近的肿瘤细胞阴性形成明显的对照。 cytokeratin 7 and 20在临床中使用中，如果同时都不表达，特异性地表示 肿瘤细胞为来源于一些上皮的肿瘤（subset of epithelial tumors），包括肾 细胞癌，前列腺癌、肝细胞癌和神经内分泌肿瘤等。
keratin vimentin GFAP tubulin
细胞膜阳性



细胞粘附分子： E-cadherin、CD31、CD56等 交联膜蛋白分子：catenin、dystrophin 等 细胞表面受体：EGFR、c-erbB2、c-kit/CD117 （酪氨酸激酶受体）等 绝大多数白细胞抗原: LCA、CD20、CD2、CD5等 表面或跨膜蛋白：Villin、BerEP4、EMA、 CEA、 CA125、EBV-LMP1等