基因克隆步骤完整版
克隆基因的方法
克隆基因的方法随着生物技术的不断发展，克隆基因的方法已经成为分子生物学和基因工程领域中不可或缺的工具。
克隆基因的方法可以用来研究基因的结构、功能和调控机制，也可以用来制备重组蛋白、疫苗和基因治疗药物等。
本文将介绍克隆基因的方法，并探讨其在生物学和医学领域中的应用。
一、克隆基因的方法克隆基因的方法包括以下步骤：1. DNA提取：从目标生物体中提取DNA，可以使用化学方法或商业化的DNA提取试剂盒。
2. PCR扩增：使用聚合酶链式反应（PCR）扩增目标基因序列。
PCR是一种体外DNA合成技术，可以在短时间内扩增目标序列，具有高灵敏度和高特异性。
3. 限制性内切酶切割：使用限制性内切酶切割PCR产物，得到两端具有粘性末端的DNA片段。
限制性内切酶是一种特异性的DNA酶，可以切割DNA的特定序列，从而产生具有特定末端的DNA片段。
4. 连接：将两端具有粘性末端的DNA片段连接起来，形成重组DNA分子。
连接可以使用DNA连接酶或T4DNA连接酶等酶催化的反应。
5. 转化：将重组DNA分子导入到宿主细胞中，使其在宿主细胞中复制和表达。
转化可以使用化学方法或电穿孔法等。
6. 筛选：筛选带有目标基因的克隆。
筛选可以使用选择性培养基、荧光标记、PCR等方法。
二、克隆基因的应用1. 基因研究克隆基因的方法可以用来研究基因的结构、功能和调控机制。
例如，可以克隆和表达目标基因蛋白，研究其生物学功能和相互作用关系。
还可以使用基因敲除和转基因技术，研究基因在生物体发育、代谢和疾病等方面的作用。
2. 蛋白制备克隆基因的方法可以用来制备重组蛋白。
例如，可以克隆并表达具有生物活性的蛋白，如生长因子、激素、抗体等。
重组蛋白可以用于药物研发、生物制剂生产和科学研究等方面。
3. 疫苗研究克隆基因的方法可以用来研制和生产疫苗。
例如，可以克隆和表达病原体的抗原蛋白，制备亚单位疫苗或基因工程疫苗。
基因工程疫苗具有高效、安全、经济等优点，已经成为疫苗研究和生产的重要手段。
基因克隆实验报告
基因克隆实验报告基因克隆实验报告引言基因克隆是一项重要的生物技术，它可以通过复制和转移特定基因来研究基因功能、生物发育和疾病治疗等方面。
本实验旨在通过基因克隆技术，将一个目标基因从一个宿主生物转移到另一个宿主生物中，并观察其表达情况和功能。
材料与方法1. 实验材料：目标基因序列、质粒、限制酶、DNA连接酶、细菌宿主等。
2. 实验步骤：a. 提取目标基因序列：通过PCR技术，从源DNA中扩增目标基因序列。
b. 制备质粒：选择合适的质粒，将其线性化。
c. 酶切与连接：使用限制酶切割目标基因序列和质粒，然后使用DNA连接酶将两者连接。
d. 转化：将连接好的质粒转移到细菌宿主中。
e. 筛选与鉴定：通过筛选培养基和PCR等方法，鉴定宿主细菌中是否成功克隆了目标基因。
结果与讨论在本实验中，我们成功地将目标基因从一个宿主生物转移到了另一个宿主生物中。
通过PCR技术，我们扩增得到了目标基因的特异片段，并在质粒上进行了酶切与连接。
随后，我们将连接好的质粒转移到了细菌宿主中，并进行了筛选与鉴定。
在筛选培养基中，我们观察到了对抗特定抗生素的细菌生长，这表明成功转化了质粒。
此外，通过PCR检测，我们也验证了目标基因的存在。
这些结果表明，我们成功地进行了基因克隆实验，并成功地将目标基因转移到了新的宿主生物中。
基因克隆的成功不仅仅是一项实验技术，它还具有广泛的应用前景。
基因克隆技术可以用于生物学研究，例如研究基因功能、生物发育和疾病机制等。
此外，基因克隆还可以用于生产重组蛋白、制备基因工程药物等方面。
然而，基因克隆技术也存在一些挑战和争议。
首先，基因克隆需要复杂的实验操作和昂贵的设备，对实验者的技术要求较高。
其次，基因克隆可能引发伦理和道德问题，例如克隆人类等。
因此，在进行基因克隆实验时，必须遵守伦理规范和法律法规，确保实验的合法性和安全性。
结论通过本实验，我们成功地进行了基因克隆，并将目标基因转移到了新的宿主生物中。
基因克隆技术在生物学研究和应用中具有重要意义，但也面临一些挑战和争议。
基因克隆的基本原理
基因克隆的基本原理
基因克隆是指通过技术手段复制和传递生物体的基因信息，使得新生命体具有与原生物一样的基因组成。
基因克隆的基本原理涉及以下几个步骤：
1. DNA提取：从源生物体中获取含有目标基因的DNA。
这可以通过多种方法实现，例如细胞溶解、离心、染色体提取等。
2. 载体DNA准备：选择一种外源载体（例如质粒或病毒）作为基因传递的工具。
这些载体DNA通常会被处理以使其具备接受外来基因并复制自身的能力。
3. DNA连接：将目标基因与载体DNA进行连接。
这可以通过酶切和连接的方法实现。
酶切指的是利用特定的内切酶，将目标基因和载体分别切割，然后通过连接酶将它们结合在一起。
4. 转化：将连接好的载体DNA导入目标细胞内。
这可以通过多种方法实现，例如热冲击、电穿孔、微注射等。
目标细胞内的酶系统将自动复制和表达导入的基因。
5. 筛选和分离：将转化后的细胞进行筛选，找出具有目标基因的克隆细胞。
通常会引入某种选择标记来帮助鉴定带有目标基因的细胞。
6. 培养和繁殖：将筛选出的克隆细胞进行培养和繁殖。
这样就可以得到大量含有目标基因的细胞群体或生物个体。
基因克隆的基本原理是通过将目标基因与载体DNA连接，并将其导入目标细胞中，利用细胞内的酶系统实现基因的复制和表达。
这个过程经历了多个步骤，包括DNA提取、载体DNA准备、DNA连接、转化、筛选和分离，最终得到带有目标基因的克隆细胞或生物个体。
8-3-基因克隆的基本过程
1. 制备目的基因和相）PCR扩增特定基因 （四）人工合成
5
1. 制备目的基因和相）PCR扩增特定基因 （四）人工合成
6
1. 制备目的基因和相b + + -
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2.DNA分子的体外连接
黏性末端 人工接头（linker）的使用 加入同聚物（homopolymer）尾 平端连接
9
2.DNA分子的体外连接
黏性末端 人工接头（linker）的使用 加入同聚物（homopolymer）尾 平端连接
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2.DNA分子的体外连接
常用方法： 遗传学方法 免疫学方法 核酸杂交法 PCR技术 酶切鉴定
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4.DNA重组体的筛选和鉴定
常用方法： 遗传学方法 免疫学方法 核酸杂交法 PCR技术 酶切鉴定
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思考题：
如 何 克 隆 p53 基 因 的 部 分 序 列 （GenBank登录号:AF136270.1）？
基因克隆的基本过程
1
基因克隆主要步骤： 制备目的基因和相关载体； 将目的基因和有关载体进行连接； 将重组的DNA导入受体细胞； DNA重组体的筛选和鉴定； DNA重组体的扩增、表达和其他研究。
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1. 制备目的基因和相）PCR扩增特定基因 （四）人工合成
黏性末端 人工接头（linker）的使用 加入同聚物（homopolymer）尾 平端连接
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2.DNA分子的体外连接
黏性末端 人工接头（linker）的使用 加入同聚物（homopolymer）尾 平端连接
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2.DNA分子的体外连接
黏性末端 人工接头（linker）的使用 加入同聚物（homopolyme人工合成
DNA合成过程示意图
基因克隆技术的基本步骤
基因克隆技术的基本步骤随着科技的不断发展，基因克隆技术越来越成为生命科学研究的重要手段。
在生命科学、医学等领域，基因克隆技术的应用十分广泛。
本文将介绍基因克隆技术的基本步骤。
一、选择载体DNA在基因克隆中，载体DNA是将外源DNA（待克隆DNA）转化进细胞的基础。
目前主要的载体DNA是质粒，其一般大小在1至20 kb之间。
质粒的选择应遵循以下几个原则：1. 合适的选体标识。
大多数载体都有一些明显的特征，例如特定的抗生素抗性或颜色，因此选择能够用于筛选的选体标识是基本原则之一。
2. 合适的克隆位点。
载体DNA上应具有克隆位点，以便将待克隆DNA插入到其中。
3. 可重复复制。
质粒必须带有在细胞内自我复制所必需的序列。
二、切割DNA通过限制性内切酶切割将待克隆DNA和载体DNA裂解成短的DNA片段。
这些片段在电泳时可以按照大小区分开，以便以后的克隆工作。
三、将外源DNA插入载体DNA外源DNA和载体DNA的连接需要使用DNA连接酶，如DNA ligase。
方法是将两个DNA片段的末端和连接起来形成一个完整的DNA分子。
连接成功后，形成了一个混合DNA。
由于载体的复制和传递，待克隆DNA也可以被大量复制。
四、将混合DNA转化进宿主细胞将混合DNA转化进宿主细胞是整个克隆过程中至关重要的一步，因为宿主细胞受到质粒的干扰，催化质粒遗传信息的传递与表达。
大多数质粒都需要在易感受性细胞中才能存在并复制。
宿主细胞的选择是非常重要的，有些宿主细胞对外源DNA的吸收和扩增效率非常高，充分利用每一个获得的外源DNA分子。
五、筛选克隆基因最后一步是克隆基因的筛选，筛选克隆基因需要具有合适的筛选方法。
常用的筛选方法是使用抗生素抗性，因为载体上通常带有抗生素基因，能够筛选那些携带载体克隆块的细胞。
克隆基因的筛选方法不止于抗生素抗性，还可以根据不同的克隆目标进行选择。
例如，当克隆目标是蛋白质时，可以使用融合蛋白法克隆兴趣的编码DNA，并利用其蛋白质结构的特点分离出融合蛋白。
利用同源序列法克隆基因的基本步骤
利用同源序列法克隆基因的基本步骤一、概述基因克隆是现代生物学研究中的重要技术手段之一，其主要目的是在体外构建包含目标基因的DNA分子。
同源序列法是一种常用的基因克隆方法，通过在一个已知基因的上下游区域找到相同的DNA序列，然后利用PCR或限制酶技术将目标基因从细胞中扩增、截取并插入到适当的质粒载体中。
本文将介绍利用同源序列法克隆基因的基本步骤。
二、材料与设备准备1. 目标基因的DNA序列- 确定目标基因的DNA序列，并设计引物2. PCR试剂盒3. DNA酶- 包括限制酶和连接酶4. DNA纯化试剂盒5. DNA电泳仪器6. 质粒载体及相关试剂7. 载体宿主细胞三、PCR扩增目标基因1. 初始步骤- 设计适当的引物，确保引物的序列与目标基因的同源序列相匹配 - 准备PCR试剂盒和PCR仪器2. PCR扩增- 按照试剂盒说明书的操作步骤，进行PCR扩增反应- 调节PCR反应条件，使扩增得到高特异性和高产量的目标DNA片段四、DNA片段纯化1. 提取PCR产物- 使用DNA纯化试剂盒，将PCR产物从反应混合物中纯化出来2. 纯化后的DNA片段检测- 使用DNA电泳仪器，检测纯化后的DNA片段是否符合预期大小五、限制酶切与质粒载体处理1. 限制酶切- 根据预先设计好的限制酶切位点，对目标基因DNA片段和质粒载体进行限制酶切2. 质粒载体处理- 在限制酶切反应后，使用连接酶将目标基因DNA片段连接到质粒载体上六、DNA片段转化与宿主细胞处理1. DNA片段转化- 将连接好的质粒载体转化到适当的宿主细胞中2. 宿主细胞处理- 处理转化后的宿主细胞，筛选带有目标基因的正反应克隆子七、目标基因测序确认1. 选取克隆子- 从宿主细胞中分离带有目标基因的正反应克隆子2. 目标基因测序- 对克隆子进行测序确认，确保目标基因的序列正确无误八、结语利用同源序列法克隆基因是一项关键而复杂的实验技术，需要准备充分的材料与设备，严格按照步骤进行操作。
整个基因克隆实验规程完整
整个基因克隆实验规程完整Document serial number【KK89K-LLS98YT-SS8CB-SSUT-SST108】一、组织总RNA的提取相关试剂：T rizol；氯仿；苯酚；异丙醇；75%乙醇；RNase-free水相关仪器：制冰机；液氮&研钵/生物样品研磨仪；高速离心机；移液器（1ml、200μl、100μl/50μl）；涡旋振荡仪；恒温金属浴。
相关耗材：解剖工具，冰盒，离心管，离心管架，吸头（1ml，200μl/300μl），一次性手套，实验手套。
实验步骤1.取暂养草鱼，冰上放置一段时间，然后解剖，剪取肠道50~100mg，放入研钵中，加入液氮迅速研磨，然后加入1ml 预冷TRIzol试剂，充分研磨至无颗粒物存在。
2.转移到离心管中，室温放置5min，使细胞充分裂解；3.按1ml Trizol加入200μl氯仿，盖上盖子，迅速充分摇匀15s，然后室温放置3min；4.4℃，,12000g 离心15min；此时混合物分为三层，下层红色的苯酚氯仿层，中间层和上层无色水相；RNA存在于无色水相中；5.小心吸取上清液，千万不要吸取中间界面，否则有DNA污染；转移至一个新的离心管，加入等体积的异丙醇，轻轻混匀；6.室温放置10min；4℃，,12000g 离心10min；7.弃上清，加入1ml 75%乙醇洗涤；涡旋，悬浮沉淀；4℃，,12000g 离心5min；8.弃上清；可以再次用75%乙醇洗涤沉淀；9.弃上清；用移液器轻轻吸取管壁或管底的残余乙醇，注意不要吸取沉淀；室温放置5min晾干沉淀；（RNA样品不要过于干燥，否则极难溶解）10.沉淀中加入30μl RNase-free水，轻弹管壁，使RNA溶解。
RNA质量检测相关试剂：溴酚蓝， TEB/TAE电泳缓冲液，溴乙锭（EB）相关仪器：（超微量分光光度计，移液器（2.5μl 或2μl 规格，10μl规格），电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，制冰机）相关耗材：（无菌无绒纸，吸头，离心管架，PCR管，PCR管架，锥形瓶，烧杯，一次性手套，实验手套，冰盒）（1）RNA纯度的检测：测定其OD260和OD280的值，根据其OD260/ OD280的比值，当其比值在1.9~2.1之间，说明提取的总RNA纯度比较高，没有蛋白质和基因组的污染。
基因工程中的基因克隆与基因表达实验总结
基因工程中的基因克隆与基因表达实验总结基因工程作为一门新兴的交叉学科，已经广泛应用于生物医学、农业、环境保护等领域。
其中，基因克隆和基因表达实验是基因工程的核心技术，对于研究基因功能和开发新药已经起到了重要作用。
本文将对基因工程中的基因克隆和基因表达实验进行总结，并探讨其在科学研究和应用中的前景。
一、基因克隆实验基因克隆是通过重组DNA技术，将感兴趣的基因从一个生物体中复制并插入到另一个生物体中的过程。
它是研究基因功能、生物制药和转基因等领域的基础。
基因克隆实验主要包括以下几个步骤：1. DNA提取与限制性内切酶切割：通过提取DNA样品，使用限制性内切酶切割将目标基因和载体DNA切割成相应片段。
2. 基因插入：将目标基因与载体DNA片段进行连接，常用的方法是使用DNA连接酶将两者黏合。
3. 转化与筛选：将连接后的DNA转入到宿主细胞中，使其成为转基因细胞。
通过选择性培养基进行筛选，可以获得拥有目标基因的转基因细胞。
通过基因克隆实验，我们可以获得不同生物体的目标基因，并进行后续的研究和应用。
例如，通过将某种植物的耐旱基因克隆到其他作物中，可以提高作物的抗旱能力，增加农作物产量。
二、基因表达实验基因表达实验是将目标基因在宿主细胞中进行转录和翻译，产生具有特定功能的蛋白质的过程。
基因表达实验是研究基因功能和制备重组蛋白等领域的重要手段。
基因表达实验主要包括以下几个步骤：1. 选择合适的表达系统：根据需要表达的蛋白质的性质和规模，选择合适的表达系统。
常用的表达系统包括细菌、酵母、哺乳动物细胞等。
2. 构建表达载体：将目标基因插入到表达载体中，通常使用限制性内切酶和DNA连接酶进行连接，并通过测序确保插入正确。
3. 细胞转染：将构建好的表达载体导入到宿主细胞中。
不同表达系统有不同的转染方法，如细菌的化学转型、酵母的电转染等。
4. 表达和纯化：经过一定时间的培养，宿主细胞会表达目标基因，合成目标蛋白质。
可以通过蛋白质纯化技术，如亲和层析、凝胶电泳等手段获得纯度较高的目标蛋白质。
基因克隆步骤完整版
基因克隆步骤完整版基因克隆是一项复杂的生物技术，可以用于生物研究、药物开发和农业改良等领域。
下面是基因克隆的完整步骤：1.设计克隆实验方案：首先，确定要克隆的基因序列。
这可以是来自同一物种的已知基因，或者是从其他物种中提取的基因。
然后，设计适当的引物（引物是专门设计用来扩增特定DNA序列的短片段）用于PCR扩增。
2.DNA提取：提取目标组织或细胞中的DNA。
常用的DNA提取方法包括酚/氯仿法、盐法和商业DNA提取试剂盒等。
3.PCR扩增：使用引物和DNA模板进行多轮PCR扩增，从而产生大量目标基因的复制。
4.凝胶电泳：将PCR产物进行凝胶电泳分析，以确认扩增是否成功，并确定目标基因的大小。
5.DNA纯化：将目标基因的PCR产物从凝胶中切割并纯化。
这通常通过使用商业DNA凝胶提取试剂盒来完成。
6.多重限制性内切酶切割和连接：根据克隆方案中的设计，使用适当的限制性内切酶切割DNA。
然后，将目标基因连接到一个载体DNA中，这个载体DNA称为克隆载体。
克隆载体通常是一个圆形的质粒DNA。
7.转化：将克隆载体插入到宿主细胞中。
这可以通过热激冷转化、电转化或化学转化等方法实现。
8.筛选转化子：使用适当的筛选方法筛选转化子。
这可以通过选择性培养基，例如含有抗生素的培养基，或者通过对转化子进行荧光筛选等方法。
9.扩增：从筛选出的阳性克隆中提取DNA，并使用PCR或其他方法进行扩增。
10.序列分析：对扩增的DNA进行序列分析，以确认克隆是否成功。
这可以通过将DNA提交给商业实验室进行测序，或者使用自动测序设备进行测序。
11.功能分析：对克隆所得基因进行功能分析。
可以通过转基因生物的研究，观察基因对生物表型的影响。
12.存储和应用：将克隆所得的基因保存在冷冻库中，以备后续研究或应用。
总结：基因克隆是一项复杂的过程，包括基因序列设计、DNA提取、PCR扩增、凝胶电泳、DNA纯化、限制性内切酶切割和连接、转化和筛选转化子、扩增、序列分析、功能分析和存储等步骤。
基因克隆实验流程
基因克隆实验流程基因克隆技术，又称重组 DNA 技术，是将目的基因与具有自主复制能力的载体DNA 进行体外重组，获得新的重组DNA后导入受体细胞中表达相应蛋白，以研究蛋白结构与功能及其与其他分子的相互作用。
一、获取目的基因目的基因就是需要研究的特定基因或DNA片段。
获取目的基因的主要方法： 1、用限制性内切酶解染色体DNA，构建基因组文库，再从基因组文库中筛选目的基因。
该法的优点是获得的目的基因的组织结构与天然基因完全相同，在结构基因中也含有内含子序列，但是也正因为这一点构成了该法最大缺点，即含有内含子的基因在原核细胞中不能表达。
原因是原核细胞不能识别并剪切插入顺序(内含子)，因而也不能表达出正确的基因产物。
2、分离纯化细胞中的mRNA，以mRNA为模板，在反转录酶作用下生成cDNA第一链，再以cDNA第一链为模板在DNA聚合酶作用下生成双链cDNA,构建cDNA文库，从中筛选所需的目的基因。
此法仅用于筛选为蛋白质编码的结构基因。
因成熟的mRNA分子中已经切除了内含子序列，具有完整的阅读框架，可在原核细胞中正确表达。
3、人工体外合成基因：由于当前人工体外合成DNA的长度有限，此法仅用于制备小分子生物活性多肽基因和小分子量蛋白基因。
在基因较大情况下，常需先合成多个DNA片段，然后拼接成完整的基因，此法还要求目的基因的全部碱基顺序已被阐明。
4、PCR法扩增基因：PCR(聚合酶链式反应)技术的出现和发展，为目的基因的寻找提供了有力技术工具。
用PCR法可选择性扩增基因组中所要研究的个别基因或DNA片段，或用反向PCR技术，先将特定mRNA反转录为cDNA第一链，然后再进行扩增。
用PCR法筛选基因，需要对目的基因的DNA序列至少有部分了解。
二、选择适当的载体按上述方法制备的目的基因如果没有合适的载体协助，很难进入受体细胞，即使能进入，往往也不能进行复制和表达，因为这些外源性DNA一般不带有复制调控系统。
为了保证目的基因或外源DNA片段能在细胞内克隆，必须将它们与适当的载体连接。
基因克隆步骤完整版
1总RNA提取(1) 液氮研磨或冰上匀浆实验材料；先将1ml Trizol加到离心(7) 弃上清，加1 mL75%乙醇，漂浮洗涤沉淀，振荡充分；再用100%乙醇清洗(8) 4o C，7,500g，离心5 min；(9) 弃上清，离心，用枪吸取多余液体，放在超净台里干燥后，加50 μL DEPC水，－80o C保存。
此操作中所用到的器皿均需经过DEPC灭活RNA酶处理。
提取的2反转录/cDNA第一链的合成RNA纯化后，即可进行反转录。
其体系为：5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time） 4μLPrimeScript RT enzyme mix Ⅰ1μL RT Primer Mix 1μL上一步的反应液10μLO 补齐至20μL RNase Free dH2 Array模板5μL 引物1 (10 μM) 1 μL引物2 (10 μM) 1 μLddHO 18μL2PCR反应条件为：94°C预变性5min；94°C变性30s，53°C退火30s，72°C延伸30s，循环36次；72°C延伸10min。
(3) 将样品倒入一个吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中），室温下13,400×g离心1 min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CB2重新套回收集管中；(4)向吸附柱CB2中加入600μL漂洗液PW（加乙醇），室温下13,400×g离心1 min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CB2重新套回收集管中；(5) 重复上一步骤；(6) 将吸附柱CB2放入收集管中，室温下13,400×g离心2 min，尽量除去漂洗液，将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干；(2) 16o C反应30分钟，所得产物保存于－4o C冰箱备用。
4.3连接产物转化E.coli DH5α(1) 将5 µL连接产物加入到100µL E.coli DH5α感受态细胞中，轻轻旋转离心管混匀内容物，冰上静置30 min；(2) 42o C水浴热激转化90 sec，立即放回冰上，放置3 min；(3) 每管加入500 µL LB培养基（室温放置），37o C 160-180 rpm振荡培养45-60 min，使菌体复苏并表达抗性基因；(4) 在含有Amp（100 µg/m L）的选择性平板上加入60-100 µL 菌液，用无菌涂布棒轻轻涂布均匀后，用Parafilm膜封好；。
基因克隆方法步骤
克隆步骤一、目的片段的回收纯化1．柱平衡步骤：向吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中）加入500ul 平衡液BL,12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
（请使用当天处理过的柱子）。
2．将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取重量。
3．向胶块中加入加入溶液PC(0.1g加入100ul，注意没过胶块)，50℃水浴放置10min左右，期间不断温和地上下翻转离心管，已确保胶块充分溶解。
4．将上一步所得溶液加入一个吸附柱（吸附柱放入收集管中），12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
5．向吸附柱CB2中加入600ul漂洗液（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
6．重复步骤5.7．将吸附柱CB2放入收集管中，12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干。
8．将吸附柱CB2放入一个干净的1.5ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加40ul的无菌水。
室温放置2min，12000rpm离心2min，收集DNA溶液。
(可以将离心后的溶液重新加到柱子中再回收一次) 9．取2ulDNA加入loading buffer点样，电泳检测是否回收出来样品。
二、目的片段与载体的连接1. 将回收的目的片段与T 载体连接，反应体系如下：目的片段 4 .5µLpMD19-T simple Vector 0.5µLSolutionⅠ 5 µLTotal 10 µL按上述体系依次加入各组分后，旋涡混匀，稍加离心后置于16℃连接过夜。
2.转化1)从-80 ℃冰箱中取50 µL 感受态细胞在冰上解冻。
2)在超净工作台上，加入10 µL 连接产物，轻轻混匀，冰上放置30 min 。
克隆表达的流程
克隆表达的流程
克隆表达的流程可以分为以下步骤：
1. 设计引物：根据目标基因的序列设计引物，包括正向引物和反向引物。
2. DNA提取：从目标细胞或组织中提取总DNA。
3. 聚合酶链式反应（PCR）扩增：使用DNA提取物作为模板，通过PCR
扩增目标基因的DNA序列。
4. 酶切与连接：将扩增得到的目标基因DNA与克隆载体（如质粒）进行酶切，产生互补的黏性末端，并将目标基因DNA连接到载体上。
此外，还有T/A克隆、传统酶切-酶连克隆和无缝克隆等克隆方法。
以上信息仅供参考，如有需要，建议查阅基因克隆相关文献或咨询相关专家。
简述基因克隆主要过程
基因克隆主要过程一、基因克隆概述基因克隆是指将一个细胞中的某个基因序列复制并转移到另一个细胞中，从而使目标基因得以表达。
基因克隆的过程包括：选择适当的宿主细胞、构建载体、将目标基因插入载体中、转化宿主细胞、筛选转化成功的细胞并培养、分离纯化目标基因等步骤。
本文将对这些过程进行详细的介绍。
二、选择适当的宿主细胞选择适当的宿主细胞是基因克隆的第一步。
通常情况下，常用的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母等。
选择宿主细胞的标准主要包括以下几个方面：1.易于培养：宿主细胞应具备简单、廉价、高效的培养条件，以便进行大规模的培养和筛选。
2.安全性：宿主细胞不应具备对人体有害的特性，以免对生物安全造成威胁。
3.生长速度：宿主细胞应具备较快的生长速度，以便加快基因克隆的进程。
三、构建载体在基因克隆中，常用的载体有质粒、病毒和人工染色体等。
构建载体的主要目的是将目标基因插入到载体中，并确保其能够被宿主细胞所识别和复制。
构建载体的步骤如下：1.获取载体：从自然界或者实验室中获取合适的载体，并通过酶切和连接等技术进行改造。
2.插入目标基因：将目标基因与载体进行连接，一般通过限制性酶切和连接酶的作用，将目标基因与载体的开放的端部连接。
3.反选：通过选择适当的标记（如抗生素耐药性基因）进行反选，以筛选出成功插入目标基因的载体。
四、将目标基因插入载体中将目标基因插入载体中是基因克隆的核心步骤，常用的方法有PCR扩增插入法、限制性内切酶法和电泳法等。
1. PCR扩增插入法PCR扩增插入法是目前常用的一种方法。
具体步骤如下：1.PCR扩增：使用PCR技术将目标基因的DNA序列扩增得到线性DNA片段。
2.载体切割：使用限制性内切酶将载体切割成开放的线性片段。
3.连接：将扩增得到的目标基因片段与载体线性片段进行连接，需注意连接时选择合适的限制性内切酶。
2. 限制性内切酶法限制性内切酶法是较为传统的方法，也是基因克隆中常用的一种方法。
具体步骤如下：1.载体切割：使用限制性内切酶将载体切割为开放的线性片段。
基因克隆引物设计步骤
基因克隆引物设计步骤基因克隆是指将感兴趣的基因从一个生物体中转移到另一个生物体中的过程。
在基因克隆中，引物是必不可少的工具，它们作为DNA扩增的起始序列，帮助将目标基因扩增出来。
引物的设计是基因克隆的关键步骤之一，下面是基因克隆引物设计的详细步骤。
1.确定目标基因序列：首先要确定你想要克隆的基因序列。
可以根据已有的序列资料获得，也可以通过测序等技术获得此序列。
2.选择扩增方法：根据实验需求选择适合的扩增方法。
常见的扩增方法有PCR、RT-PCR、RACE等。
3.获取引物序列：根据目标基因序列，设计引物序列。
引物通常由两个部分组成：前向引物和反向引物。
前向引物与目标序列的上游区域互补，反向引物与目标序列的下游区域互补。
引物长度通常为18-22个碱基对。
4.引物设计原则：-引物长度：引物长度应在18-22个碱基对之间，过短则会导致特异性降低，过长则会导致引物的结构稳定性下降。
-GC含量：引物的GC含量应在40%-60%之间，过高或过低的GC含量会导致引物的熔解温度变化，降低引物与目标序列的互补性。
-特异性：引物应具有高度的特异性，避免与其他基因或非目标序列发生互补。
5.避免引物二聚体和髙聚物的形成：-引物二聚体：引物二聚体是指两个引物之间通过碱基配对形成的复合物。
二聚体的形成会导致PCR扩增效率降低甚至完全失败。
要避免引物二聚体的形成，可以使用引物设计软件进行计算和优化。
-引物髙聚物：引物髙聚物是指引物之间互相结合形成的长链。
髙聚物的形成会抑制PCR扩增的产物的生成，同样可使用引物设计软件进行计算和优化。
6.核酸序列分析软件的使用：核酸序列分析软件可以帮助你检查设计引物的性能，如特异性、互补性等。
常用的软件有Primer3、Oligo Analyzer等。
7.引物合成：找到合适的引物序列后，可以将其提交给寡核苷酸合成机构进行合成。
合成的引物会被送到实验室进行后续的基因克隆实验。
总结起来，基因克隆引物设计的关键是确定目标基因序列、选择合适的扩增方法、根据引物设计原则设计引物、避免引物二聚体和髙聚物的形成，并使用核酸序列分析软件进行验证。
转录组序列基因克隆
转录组序列基因克隆
转录组序列基因克隆是一种用于从转录组数据中克隆基因的方法。
以下是一般的步骤：
1. 获得转录组数据：通常通过 RNA 测序（RNA-seq）技术获得转录组数据。
这些数据提供了有关细胞或组织中表达的所有 RNA 分子的信息。
2. 筛选目标基因：根据研究的目的，从转录组数据中筛选出感兴趣的目标基因。
这可以基于特定的表达模式、功能注释或其他相关的生物信息学分析。
3. 设计引物：针对目标基因的序列，设计特异性的引物用于 PCR 扩增。
4. PCR 扩增：使用设计的引物，从转录组数据对应的 cDNA 文库中进行 PCR 扩增。
这将产生目标基因的特定片段。
5. 克隆和测序：将 PCR 扩增的产物克隆到适当的载体中，并进行测序以确认所克隆的序列的准确性。
6. 功能分析：对克隆的基因进行进一步的功能分析，例如表达分析、蛋白质表达和功能研究等。
需要注意的是，转录组序列基因克隆的成功与否取决于许多因素，包括转录组数据的质量、引物的设计、PCR 条件等。
在进行该方法之前，建议对相关技术和实验步骤有一定的了解，并根据具体情况进行优化和调整。
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1总RNA提取
(1) 液氮研磨或冰上匀浆实验材料；先将1ml Trizol加到离心管中待用
(2) 将研磨好的样品加到离心管中混匀，室温放置5 min；打开离心机预冷
(3) 加200 µL氯仿，振荡15 sec，室温放置3 min，分层；
(4) 4o C，12,000g，离心15 min；
(5) 取上清，加500 μL异丙醇，混匀，室温放置10 min；
(6) 4o C，12,000g，离心10 min；
(7) 弃上清，加1 mL75%乙醇，漂浮洗涤沉淀，振荡充分；再用100%乙醇清洗
(8) 4o C，7,500g，离心5 min；
(9) 弃上清，离心，用枪吸取多余液体，放在超净台里干燥后，加50 μL DEPC 水，－80o C保存。
此操作中所用到的器皿均需经过DEPC灭活RNA酶处理。
提取的总RNA 需经RNA电泳检测质量，并用紫外分光光度计测定浓度。
OD260值为核酸的吸收值，OD280值为蛋白的吸收值，OD260/280值在1.8-2.0间一般说明该核酸蛋白含量在允许的范围内，可正常使用；此外还有OD230值为多糖和酚类的吸收值，比较干净的核酸OD260/230值能达到2.2左右。
RNA浓度计算公式：总RNA 浓度（µg/mL）=A260×稀释倍数×40。
2反转录/cDNA第一链的合成
纯化RNA以去除基因组DNA，操作按TaKaRa公司的PrimeScript RT reagent with gDNA Eraser(Perfect Real Time)说明书进行。
其体系为：
Total RNA1μg
5× gDNA Eraser Buffer2μL
gDNA Eraser1μL
RNase Free dH2O补齐至10μL 条件为：42o C，2min；
RNA纯化后，即可进行反转录。
其体系为：
5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time）4μL
PrimeScript RT enzyme mix Ⅰ1μL
RT Primer Mix 1μL
上一步的反应液10μL
RNase Free dH2O补齐至20μL 操作条件为：
(1) 37o C放置15 min；(2) 85o C，5 sec；(3) 4o C保存。
3 PCR
按TaKaRa公司的Premix Taq Version 2.0操作，，PCR反应体系如下：
Premix Taq25 μL
模板5μL
引物1 (10 μM) 1 μL
引物2 (10 μM) 1 μL
ddH2O18μL PCR反应条件为：94°C预变性5min；94°C变性30s，53°C退火30s，72°C 延伸30s，循环36次；72°C延伸10min。
PCR反应完毕，取5μL反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳（若割胶回收则用10μL反应产物）。
4 基因克隆及测序
4.1 PCR产物切胶回收
将PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳，在紫外灯下观察并切下预期大小的DNA片段。
使用TIANGEN公司的Universal DNA Purification Kit割胶回收试剂盒进行纯化，步骤如下：
(1)平衡吸附柱：向吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中）加入500μL平衡液BL，13,400×g离心1 min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CB2重新套回收集管中；
(2) 按100 mg agarose胶加入100μL 溶液PC，置于50o C中10 min左右，中途混匀几次，至胶完全融化；
(3) 将样品倒入一个吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中），室温下13,400×g离心1 min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CB2重新套回收集管中；
(4)向吸附柱CB2中加入600μL 漂洗液PW（加乙醇），室温下13,400×g离心1 min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CB2重新套回收集管中；
(5) 重复上一步骤；
(6) 将吸附柱CB2放入收集管中，室温下13,400×g离心2 min，尽量除去漂洗液，将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干；
(7) 将柱子套入一新的灭菌1.5 mL离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50µL 洗脱缓冲液，室温放置2分钟，13,400×g室温离心2 min，收集到的洗脱液即为回收的DNA纯化液；
(8) 取5µL的纯化液体进行1%琼脂糖凝胶电泳，以检查纯度，并测量溶液中DNA含量。
4.2目的片段与载体连接
(1) 胶回收产物与T载体连接体系，参考Takara公司pMD18-T载体的试剂盒说明书。
在灭菌的0.5 mL 离心管中配制如下溶液（10 μL）：
回收DNA4μL
Ligation Solution5μL
pMD18-T Vector1μL
(2) 16o C反应30分钟，所得产物保存于－4o C冰箱备用。
4.3连接产物转化E.coli DH5α
(1) 将5 µL连接产物加入到100µL E.coli DH5α感受态细胞中，轻轻旋转离心管混匀内容物，冰上静置30 min；
(2) 42o C水浴热激转化90 sec，立即放回冰上，放置3 min；
(3) 每管加入500 µL LB培养基（室温放置），37o C 160-180 rpm振荡培养45-60 min，使菌体复苏并表达抗性基因；
(4) 在含有Amp（100 µg/mL）的选择性平板上加入60-100 µL 菌液，用无菌涂布棒轻轻涂布均匀后，用Parafilm膜封好；
(5) 将培养皿正放，37o C约50 min，待液体全部吸收后，倒置平板继续培养10-16 h。
4.4转化子的筛选及鉴定
(1) 用无菌枪头挑取LB平板上3-5个单菌落，分别接种到3.5 mL LB液体培养基中（含100 µg/mL Amp），37o C，165rpm振荡培养10-12 h；
(2) 用5 µL菌液做模板，进行PCR鉴定（50 µL 体系），操作步骤同3。
阳性菌液由Invitrogen生物公司测序鉴定，余下的菌液4o C保存备用；
(3) 测序结果在Genbank数据库中进行比对分析。