基因克隆步骤完整版

1总RNA提取

(1) 液氮研磨或冰上匀浆实验材料；先将1ml Trizol加到离心管中待用

(2) 将研磨好的样品加到离心管中混匀，室温放置5 min；打开离心机预冷

(3) 加200 µL氯仿，振荡15 sec，室温放置3 min，分层；

(4) 4o C，12,000g，离心15 min；

(5) 取上清，加500 μL异丙醇，混匀，室温放置10 min；

(6) 4o C，12,000g，离心10 min；

(7) 弃上清，加1 mL75%乙醇，漂浮洗涤沉淀，振荡充分；再用100%乙醇清洗

(8) 4o C，7,500g，离心5 min；

(9) 弃上清，离心，用枪吸取多余液体，放在超净台里干燥后，加50 μL DEPC 水，－80o C保存。

此操作中所用到的器皿均需经过DEPC灭活RNA酶处理。提取的总RNA 需经RNA电泳检测质量，并用紫外分光光度计测定浓度。OD260值为核酸的吸收值，OD280值为蛋白的吸收值，OD260/280值在1.8-2.0间一般说明该核酸蛋白含量在允许的范围内，可正常使用；此外还有OD230值为多糖和酚类的吸收值，比较干净的核酸OD260/230值能达到2.2左右。RNA浓度计算公式：总RNA 浓度（µg/mL）=A260×稀释倍数×40。

2反转录/cDNA第一链的合成

纯化RNA以去除基因组DNA，操作按TaKaRa公司的PrimeScript RT reagent with gDNA Eraser(Perfect Real Time)说明书进行。其体系为：

Total RNA1μg

5× gDNA Eraser Buffer2μL

gDNA Eraser1μL

RNase Free dH2O补齐至10μL 条件为：42o C，2min；

RNA纯化后，即可进行反转录。其体系为：

5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time）4μL

PrimeScript RT enzyme mix Ⅰ1μL

RT Primer Mix 1μL

上一步的反应液10μL

RNase Free dH2O补齐至20μL 操作条件为：

(1) 37o C放置15 min；(2) 85o C，5 sec；(3) 4o C保存。

3 PCR

按TaKaRa公司的Premix Taq Version 2.0操作，，PCR反应体系如下：

Premix Taq25 μL

模板5μL

引物1 (10 μM) 1 μL

引物2 (10 μM) 1 μL

ddH2O18μL PCR反应条件为：94°C预变性5min；94°C变性30s，53°C退火30s，72°C 延伸30s，循环36次；72°C延伸10min。

PCR反应完毕，取5μL反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳（若割胶回收则用10μL反应产物）。

4 基因克隆及测序

4.1 PCR产物切胶回收

将PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳，在紫外灯下观察并切下预期大小的DNA片段。使用TIANGEN公司的Universal DNA Purification Kit割胶回收试剂盒进行纯化，步骤如下：

(1)平衡吸附柱：向吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中）加入500μL平衡液BL，13,400×g离心1 min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CB2重新套回收集管中；

(2) 按100 mg agarose胶加入100μL 溶液PC，置于50o C中10 min左右，中途混匀几次，至胶完全融化；

(3) 将样品倒入一个吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中），室温下13,400×g离心1 min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CB2重新套回收集管中；

(4)向吸附柱CB2中加入600μL 漂洗液PW（加乙醇），室温下13,400×g离心1 min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CB2重新套回收集管中；

(5) 重复上一步骤；

(6) 将吸附柱CB2放入收集管中，室温下13,400×g离心2 min，尽量除去漂洗液，将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干；

(7) 将柱子套入一新的灭菌1.5 mL离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50µL 洗脱缓冲液，室温放置2分钟，13,400×g室温离心2 min，收集到的洗脱液即为回收的DNA纯化液；

(8) 取5µL的纯化液体进行1%琼脂糖凝胶电泳，以检查纯度，并测量溶液中DNA含量。

4.2目的片段与载体连接

(1) 胶回收产物与T载体连接体系，参考Takara公司pMD18-T载体的试剂盒说明书。在灭菌的0.5 mL 离心管中配制如下溶液（10 μL）：

回收DNA4μL

Ligation Solution5μL

pMD18-T Vector1μL

(2) 16o C反应30分钟，所得产物保存于－4o C冰箱备用。

4.3连接产物转化E.coli DH5α

(1) 将5 µL连接产物加入到100µL E.coli DH5α感受态细胞中，轻轻旋转离心管混匀内容物，冰上静置30 min；

(2) 42o C水浴热激转化90 sec，立即放回冰上，放置3 min；

(3) 每管加入500 µL LB培养基（室温放置），37o C 160-180 rpm振荡培养45-60 min，使菌体复苏并表达抗性基因；

(4) 在含有Amp（100 µg/mL）的选择性平板上加入60-100 µL 菌液，用无菌涂布棒轻轻涂布均匀后，用Parafilm膜封好；

(5) 将培养皿正放，37o C约50 min，待液体全部吸收后，倒置平板继续培养10-16 h。

4.4转化子的筛选及鉴定

(1) 用无菌枪头挑取LB平板上3-5个单菌落，分别接种到3.5 mL LB液体培养基中（含100 µg/mL Amp），37o C，165rpm振荡培养10-12 h；

(2) 用5 µL菌液做模板，进行PCR鉴定（50 µL 体系），操作步骤同3。阳性菌液由Invitrogen生物公司测序鉴定，余下的菌液4o C保存备用；

(3) 测序结果在Genbank数据库中进行比对分析。