小鼠生殖细胞特异性转录因子SOHLH1调控Sox30基因表达的机制

小鼠生殖细胞特异性转录因子SOHLH1调控Sox30基因表

达的机制

齐婉婧;孙奇;李媛;张雪;金美玉;何岩;郑志红

【摘要】目的 SOHLH1(Spermatogenesis-and oogenesis-specific bHLH transcription factor-1)和SOX30(SRY box)是与精子发生相关的转录因

子,Sohlh1与Sox30的基因敲除雄鼠均丧失生育能力.出生后7天Sohlh1基因敲除雄鼠DNA芯片显示Sox30表达显著下调,本文探究了早期发育相关转录因子SOHLH1对精子发生后期的关键基因Sox30基因的转录调控作用.方法构建Sox30启动子荧光素酶表达质粒,瞬时共同转染Sox30荧光素酶表达质粒和Sohlh1真核表达质粒并利用荧光素酶活性测定实验检测荧光值.通过染色质免疫共沉淀实验检测SOHLH1与Sox30启动子DNA序列特异序列的结合情况筛选主要激活位点.结果共转染Sohlh1真核表达质粒和Sox30启动子区域荧光素酶质粒的实验组荧光素酶活性高于对照组.SOHLH1与Sox30启动子上的特异性位点结合,在-489 bp位点的结合作用最强.结论精子发生早期重要转录因子SOHLH1可以直接激活顶体形成相关基因Sox30转录,-489 bp(CAGGTG)为主要特异性结合位点,丰富了精子发生中延时翻译表达调控的现象并进行了调控机制的初步探索.【期刊名称】《中国比较医学杂志》

【年(卷),期】2019(029)007

【总页数】6页(P36-41)

【关键词】精子发生;Sox30;ChIP;SOHLH1;小鼠

【作者】齐婉婧;孙奇;李媛;张雪;金美玉;何岩;郑志红

【作者单位】中国医科大学实验动物部,沈阳 110001;中国医科大学实验动物部,沈阳 110001;中国医科大学实验动物部,沈阳 110001;中国医科大学实验动物部,沈阳110001;中国医科大学实验动物部,沈阳 110001;中国医科大学实验动物部,沈阳110001;中国医科大学实验动物部,沈阳 110001

【正文语种】中文

【中图分类】R-33

雄性生殖细胞经历一系列特定基因程序性表达，使具有有丝分裂活性的原始生殖细胞发育为成熟精子的过程被称为精子发生。精子发生起源于精原干细胞，经历精原细胞的有丝分裂期和精母细胞的减数分裂期[1]，在精子形成期圆形精子细胞经历

复杂的结构重塑最终成为成熟精子[2]。精卵发生特异表达螺旋-环-螺旋转录因子1 (Spermatogenesis- and oogenesis-specific bHLH transcription factor-1，Sohlh1)编码357个氨基酸含有一个bHLH结构域，SOHLH1可以形成异源二聚

体或同型二聚体并与DNA上的E-box序列(CANNTG)结合[3]调控下游基因表达。SOHLH1在雄性生殖细胞中特异表达，主要表达于A1-A4型精原细胞，在Int型及B型精原细胞中该蛋白逐渐消失[4]。SOHLH1是涉及精原细胞分化的重要转录因子[4]，调控c-Kit表达[5]、与SOHLH2形成异源二聚体下调Stra8表达[6-8]并参与精子发生相关的重要信号通路[9]从而影响精原细胞发育和减数分裂。本课题

组前期研究发现Sohlh1基因敲除纯合子雄性小鼠不育，精原细胞发育及分化异常导致进入减数分裂的精母细胞减少，精母细胞大量凋亡，无成熟精子产生。基因芯片检测结果显示出生后7天野生型雄鼠与Sohlh1基因敲除雄鼠睾丸组织中

Sox30、Rnf17等精子发生中关键基因均出现表达差异[10]，推测SOHLH1可能

直接或间接调控Sox30基因转录。

Sox30是睾丸生殖细胞特异表达基因Sox(Sry-related High Motility Group (HMG) box)家族H亚族唯一的成员，含有3个外显子，编码蛋白具有一个HMG box结构域[11]，参与性腺发生、精子发生[12]并且与顶体形成相关[13]。Sox30基因敲除雄性小鼠无生育能力，精子发生阻滞于精子形成期，圆形精子细胞核表面没有参与顶体形成的顶体颗粒[14]。目前，关于转录因子调控Sox30表达未见文献报道。我们利用生物信息学预测 Sox30基因上游启动子区域，发现存在SOHLH1转录因子结合的E-box序列，本研究旨在探究精原细胞早期发育相关的重要转录因子SOHLH1参与精子发生后期相关基因Sox30的转录调控机制，并进一步筛选Sox30基因启动子序列上SOHLH1特异性结合位点的DNA序列。

1 材料和方法

1.1 实验动物

本实验中共使用7周龄的SPF级C57BL/6J雄性小鼠9只(三次重复实验)，体重约22～24 g(误差不大于10%)，来源于中国医科大学实验动物部[SCXK(辽) 2018-0004]。取材在中国医科大学实验动物科学部屏障动物实验设施进行

[SYXK(辽)2018-0008]，并按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。本实验经中国医科大学实验动物福利与伦理委员会(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)审查通过，审批编号：No. 2017018。

1.2 主要试剂与仪器

Tris平衡酚(鼎国生物技术有限公司，北京)，PCR引物(Genescript，南京)，Q5® High-Fidelity DNA Polymerase(Cat.#M0491S，NEB，美国)，Axygen mini-prepare 质粒提取试剂盒(Cat.AP-MN-P-50)、AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(Cat.AP-GX-50)、AxyPrep PCR清洁试剂盒(Cat.AP-PCR-50)(Axygen，美国)，pMD18-T Vector、E. coli DH5α感受态大肠杆菌、限制性内切酶HindⅢ和KpnⅠ(宝生物公司，大连)，pGL3-Basic质粒、pRL-TK质粒(Promega，美国)，