《植物细胞融合实验》PPT课件
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第六章 植物细胞融合（实验）
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1
一、细胞融合的目的和意义
细胞融合能实现远缘杂交。其意义在 于打破了仅仅依赖有性杂交重组基因创造 新种的界限，有可能形成有性杂交方法无 法获得的新型杂种植物，广泛组合各种基 因型，扩大了遗传物质的重组范围。
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2
二、细胞融合（cell fusion)概念
在外力（诱导剂或促融合剂）作用下，两个或两 个以上的异源细胞或原生质体相互接触，从而发生 膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞的现象。
通过细胞培养技术，这个细胞有可能发育成完 整的生物个体，这个杂种后代有可能兼有两个上代 的一些优良性状。
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3
细胞在融合过程中发生的主要变化：
呈致密状态的体细胞在促融合剂的作用
15
membranes are
microseconds
fused
is applied in
completely and
order to
the cytoplasm
permeate the
has mixed
membrane. The together. Only
membranes
the nuclei
then fuse.
在众多的化学试剂中，PEG应用最为
广泛，因PEG液比病毒更易制备和控制、
活性稳定、使用方便、而且促进细胞融合
的能力更强。PEG是一种多聚化合物。
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7
பைடு நூலகம்
PEG诱导原生质体融合的机理： 带有大量负电荷的PEG与水之间的氢
键结合，使溶液中自由水消失，由于高度 脱水引起原生质体凝集，形成大小程度不 同的凝集物。原生质体发生皱缩并大大扭 曲变形，邻近原生质体之间紧密接触。
下，细胞膜的性质发生变化。 首先出现
细胞凝集现象；然后部分凝集细胞之间的
膜发生粘连；继而融合形成多核细胞；在
培养过程中多核细胞又进行核的融合而成
为单核的杂种细胞，而那些不能形成单核
的融合细胞在培养过程中逐渐死亡。
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4
三、细胞融合技术原理和方法
由于体外培养的细胞很少会发生自发 融合（融合频率大约在10-4~10-6之间）， 因此要采用生物、化学或物理的方法人为 地促使细胞融合。
remain separate.
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D Entire fusion product:
The nuclei are now fused as well. As a rule, the number of chromosome s is reduced.
15
Fusion phases of oat protoplasts (Avena sativa)
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16
实际操作： 先把待融合的细胞或原生质体混合，取
样置于100V/cm的高频交流电场中，在非 均匀交流电场中形成项链状排列；
完整烟草原生质体（40×） 原生质体成串（40×）
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17
再用1~5V/cm直流电脉冲/微秒冲击细 胞或原生质体的粘接点，细胞膜降解造成 若干微孔，于是在膜之间形成通道，使细 胞质得以交换；最后导致新的球状细胞的 形成。
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5
促细胞融合的方法有： （一）病毒促进细胞融合
其中仙台病毒（HVJ）是最早用于动物细胞融
合的融合剂。
（二）化学融合剂促进细胞融合
主要包括盐类融合剂、聚乙二醇（PEG）、
二甲亚砜（DMSO）、甘油-醋酸酯、油酸盐、脂
质、Ca2+配合物等。
（三）电处理融合法
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6
聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG)融合
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10
电融合（electrofusion technique)法：
电处理融合法是20世纪80年代发展起 来的细胞融合技术，使融合率大为提高。
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11
Model ECM830 from BTX
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12 Electroporator 2510 from Brinkmann
储备液，灭菌备用。
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21
（2）使用时再加入： 纤维素酶 R-10 0.8% 果胶酶 R-10 1%
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14
A Alignment:
Cells are brought into close contact by means of dielectrophor esis.
B Fusion pulse: C Heterokaryon
phase:
A squarewave
pulse of a mere The cell
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8
在原生质体细胞膜与膜紧密接触的部
位，膜内蛋白质颗粒易位并凝聚。接着可
能是相邻的剥去蛋白质的细胞膜间的类脂
质与类脂质反应。继之，类脂质分子的扰
动和重排导致接触的细胞膜局部发生融合，
形成很小的细胞质桥，之后它逐渐扩大，
两个原生质体最终融合。
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9
使用化学促融剂时，Ca2+是必需的。 关于Ca2+的作用机理，有的认为是Ca2+和 PO43-形成不溶于水的配合物，成为细胞间 的钙桥，由此引起融合。也有解释为Ca2+ 结合到带负电磷脂的电离基上，使磷脂分 子在膜上相互分离，由此引起融合。
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18
电融合法优点（与PEG法比较）：
1、融合率高； 2、重复性强；
Electrofusion
3、诱导仅发生在质膜接触部位，对细胞 或原生质
体伤害小；
4、融合是在同步状态下进行，活细胞数目多；
5、装置精巧，方法简单，可在显微镜下观察或录
像融合过程；
6、免去PEG诱导后的洗涤过程，诱导过程可控制
电融合过程的分子机制： 是以电降解及双向电泳的联合作用为
基础。通过电泳，两细胞膜紧密接触，且 膜表面的蛋白质分子分离，产生了无蛋白 的类脂区。
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13
电脉冲作用时引起膜结构局部扰乱， 出现小孔洞。而相对的脂双层间分子在范 德华力作用下，形成脂分子桥。由于连接 处的细胞膜表面曲率大，处于高张力状态， 在热力学上是不稳定的，所以最终导致两 细胞逐渐融合成一个圆形的大球状细胞。
性强。
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19
四、实验材料、试剂和仪器
1.材料
无菌烟草叶片、洋葱根尖
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20
2.试剂
1）酶混合液
配制分两部进行：
（1）将CaCl2.2H2O NaH2PO4.2H2O MES
7 mmol/L 0.7mmol/L 3 mmol/L
甘露醇
0.5 mmol/L
用重蒸馏水溶解，调pH5.6，定容为酶
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一、细胞融合的目的和意义
细胞融合能实现远缘杂交。其意义在 于打破了仅仅依赖有性杂交重组基因创造 新种的界限，有可能形成有性杂交方法无 法获得的新型杂种植物，广泛组合各种基 因型，扩大了遗传物质的重组范围。
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二、细胞融合（cell fusion)概念
在外力（诱导剂或促融合剂）作用下，两个或两 个以上的异源细胞或原生质体相互接触，从而发生 膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞的现象。
通过细胞培养技术，这个细胞有可能发育成完 整的生物个体，这个杂种后代有可能兼有两个上代 的一些优良性状。
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细胞在融合过程中发生的主要变化：
呈致密状态的体细胞在促融合剂的作用
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membranes are
microseconds
fused
is applied in
completely and
order to
the cytoplasm
permeate the
has mixed
membrane. The together. Only
membranes
the nuclei
then fuse.
在众多的化学试剂中，PEG应用最为
广泛，因PEG液比病毒更易制备和控制、
活性稳定、使用方便、而且促进细胞融合
的能力更强。PEG是一种多聚化合物。
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பைடு நூலகம்
PEG诱导原生质体融合的机理： 带有大量负电荷的PEG与水之间的氢
键结合，使溶液中自由水消失，由于高度 脱水引起原生质体凝集，形成大小程度不 同的凝集物。原生质体发生皱缩并大大扭 曲变形，邻近原生质体之间紧密接触。
下，细胞膜的性质发生变化。 首先出现
细胞凝集现象；然后部分凝集细胞之间的
膜发生粘连；继而融合形成多核细胞；在
培养过程中多核细胞又进行核的融合而成
为单核的杂种细胞，而那些不能形成单核
的融合细胞在培养过程中逐渐死亡。
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三、细胞融合技术原理和方法
由于体外培养的细胞很少会发生自发 融合（融合频率大约在10-4~10-6之间）， 因此要采用生物、化学或物理的方法人为 地促使细胞融合。
remain separate.
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D Entire fusion product:
The nuclei are now fused as well. As a rule, the number of chromosome s is reduced.
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Fusion phases of oat protoplasts (Avena sativa)
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实际操作： 先把待融合的细胞或原生质体混合，取
样置于100V/cm的高频交流电场中，在非 均匀交流电场中形成项链状排列；
完整烟草原生质体（40×） 原生质体成串（40×）
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再用1~5V/cm直流电脉冲/微秒冲击细 胞或原生质体的粘接点，细胞膜降解造成 若干微孔，于是在膜之间形成通道，使细 胞质得以交换；最后导致新的球状细胞的 形成。
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促细胞融合的方法有： （一）病毒促进细胞融合
其中仙台病毒（HVJ）是最早用于动物细胞融
合的融合剂。
（二）化学融合剂促进细胞融合
主要包括盐类融合剂、聚乙二醇（PEG）、
二甲亚砜（DMSO）、甘油-醋酸酯、油酸盐、脂
质、Ca2+配合物等。
（三）电处理融合法
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聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG)融合
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电融合（electrofusion technique)法：
电处理融合法是20世纪80年代发展起 来的细胞融合技术，使融合率大为提高。
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11
Model ECM830 from BTX
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12 Electroporator 2510 from Brinkmann
储备液，灭菌备用。
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（2）使用时再加入： 纤维素酶 R-10 0.8% 果胶酶 R-10 1%
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A Alignment:
Cells are brought into close contact by means of dielectrophor esis.
B Fusion pulse: C Heterokaryon
phase:
A squarewave
pulse of a mere The cell
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在原生质体细胞膜与膜紧密接触的部
位，膜内蛋白质颗粒易位并凝聚。接着可
能是相邻的剥去蛋白质的细胞膜间的类脂
质与类脂质反应。继之，类脂质分子的扰
动和重排导致接触的细胞膜局部发生融合，
形成很小的细胞质桥，之后它逐渐扩大，
两个原生质体最终融合。
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使用化学促融剂时，Ca2+是必需的。 关于Ca2+的作用机理，有的认为是Ca2+和 PO43-形成不溶于水的配合物，成为细胞间 的钙桥，由此引起融合。也有解释为Ca2+ 结合到带负电磷脂的电离基上，使磷脂分 子在膜上相互分离，由此引起融合。
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电融合法优点（与PEG法比较）：
1、融合率高； 2、重复性强；
Electrofusion
3、诱导仅发生在质膜接触部位，对细胞 或原生质
体伤害小；
4、融合是在同步状态下进行，活细胞数目多；
5、装置精巧，方法简单，可在显微镜下观察或录
像融合过程；
6、免去PEG诱导后的洗涤过程，诱导过程可控制
电融合过程的分子机制： 是以电降解及双向电泳的联合作用为
基础。通过电泳，两细胞膜紧密接触，且 膜表面的蛋白质分子分离，产生了无蛋白 的类脂区。
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13
电脉冲作用时引起膜结构局部扰乱， 出现小孔洞。而相对的脂双层间分子在范 德华力作用下，形成脂分子桥。由于连接 处的细胞膜表面曲率大，处于高张力状态， 在热力学上是不稳定的，所以最终导致两 细胞逐渐融合成一个圆形的大球状细胞。
性强。
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四、实验材料、试剂和仪器
1.材料
无菌烟草叶片、洋葱根尖
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20
2.试剂
1）酶混合液
配制分两部进行：
（1）将CaCl2.2H2O NaH2PO4.2H2O MES
7 mmol/L 0.7mmol/L 3 mmol/L
甘露醇
0.5 mmol/L
用重蒸馏水溶解，调pH5.6，定容为酶