亚细胞定位分析

重组蛋白在耻坂分枝杆菌中的亚细胞定位分析

分级分离实验

(1)重组菌培养至对数期（OD600=0.8-1.0)，加入终浓度为28mM的己内醜胺，继续培养16h 诱导目的蛋白表达，10000rpm/min离心5min收集菌体，PBS洗涤菌体3次，最后用

8mLPBS重悬菌体

(2)超声破碎细胞，4℃，3000g离心5min，收集上清（全细胞裂解液）

(3)4℃，27，000g(RCF)离心40min，获得细胞壁组分，上清转移至一新的超高速离心管内

(4)4℃，100，000g(RCF)离心2h，吸出上清（此为细胞质组分)，沉淀为细胞膜组分

(5)Western blotting检测目的蛋白在细胞中各组分的情况

蛋白酶K降解分析

(1)将经己内酰胺诱导后的重组菌等分成三部分，PBS洗菌体3次，最后用5mL PBS重悬菌体

(2)分别在其中两个样品中加入蛋白酵K，终浓度为l00ug/mL，37℃下分别孵育5min,

l0min,加入蛋白抑制剂苯甲磺醜基氟化物(PMSF)至终浓度为100 nM

(3)样品在4℃，8000g下离心5min, PBS洗样品，最终用200ul PBS重悬

(4)样品用Western blotting检测分析