高通量药物筛选与创新药物研究--李佳(国家新药筛选中心)

化合物库
筛选
筛选模型 分子生物学 细胞生物学 基因组学 蛋白组学
结构优化
先导化合物
生物信息学 结构生物学 计算机辅助药物设计 药物化学
高通量筛选（HTS）
运用自动化的筛选系统在短时间内、在特定的
筛选模型上完成数以千计，甚至万计化合物样品的
活性测试。一般而言，日筛选能力应在10000次以上
方可以称为高通量筛选。
尺寸变化
生物 大 生物 大 分子
分子
+
FP 信号增强
生物 大
分子
+
+
生物 大
分子
FP 信号减弱
竞争性结合
FP 信号减弱 +
IMAP
Protein-DNA Binding FP HTS
Ser/Th Kinase Competitive FP Assay
荧光共振能转移(FRET)
荧光共振能转移是指供体受激发后不发射出光子而将 激发的能量转移到受体的现象。这种方法可检测生理
ATP PI(4,5)P2
PI(3,4,5)P3
AlphaScreen for cAMP
Biotin-cAMP 680 nm
Donor-Streptavidin
Acceptor-Anti-cAMP 520-620 nm
BRET
闪烁亲近检测法 (Scintillation Proximity Assay, SPA)
-射线作用与微粒上的闪烁剂发射可检测的光
SPA 微粒
-射线在介质中 被消散
放射性标记配体
放射性标记配体与SPA微粒上 的生物大分子结合，亲近闪烁 产生可检测的光
未标记配体不产生 亲近闪烁
FlashPlate - SPA without Beads
Bind Receptor Or Target to Plate
Donor
Wavelength Absorbance
Acceptor
Wavelength
D
A
Efficient energy transfer: 10–100 Å
Fluorescence
荧光共振能转移
在大多数情况下，供体与受体标记的荧光染料是不同 的，供体的荧光会因为受体的存在而发生淬灭。一般 荧光素和四甲基罗丹明（tetramethylrhodamine）之 间发生50%有效能量转移所需距离为55 埃，EDANS和 DABCYL之间为33埃，EDANS和荧光素之间为46埃。 FRET主要用于淬灭分析或与淬灭相关的分析。
高通量药物筛选与创新药物研究
中国科学院上海药物研究所 国家新药筛选中心
李佳
内容
• 高通量药物筛选：
模型建立、化合物制备、自动化、数据处理
• 我国高通量药物筛选的现状
• 我们在高通量药物筛选与创新药物研究方面的策略：
组合筛选模型体系、分子家族筛选模型体系、化学生物学方法研究活 性化合物作用机制
• 我们在高通量药物筛选与创新药物研究方面的研究实例
Radiolabeled Tracer and Sample added
Only bound Tracer is Measured
常用的蛋白水解酶检测方法
蛋白水解酶
1.
R
R 吸收光或荧光方法检测产物 R
蛋白水解酶
2.
Biotin
125
I
Biotin
125
I
用抗生物素链菌素包被的SPA微粒或 Flashplates
FLIPR functional screening assay
L

GTP GDP PLC inositol phosphates
Fluorescent dye
+
Ca2+
fluorescent signal
报告基因
• 报告基因受一个可诱导转录因子的调控，从而响应 受体的活动，并指导报告蛋白的合成。 • 对应不同的细胞株，可有多种报告基因和载体可供 选择。常用的有萤火虫荧光素酶(luciferase)、分泌 型碱性磷酸酯酶(secreted alakaline phosphatase, SEAP) 、 氯 霉 素 乙 酰 转 移 酶 (chloramiphenicol acetyltransferase, CAT) 、 - 半 乳 糖 苷 酶 (galactosidase)、-内酰胺酶和绿色荧光蛋白(GFP)。
常用的激酶检测方法
33
激酶
PO43-
1.
Biotin + AT P
33
Biotin
抗生物素链菌素包被的SPA微粒或 Flashplates 捕获生物素标记组分 或磷酸纤维素板捕获磷酸化组分
TM
PO43-
激酶
2.
Biotin + ATP
Biotin
应用铕标记抗磷酸化抗体及抗生物 素链菌素- APC进行均相 FRET检测
状态下相互作用分子间的距离。产生FRET需要满足三
个条件：供体和受体间距离接近（10~100埃）；供体 的发射光谱与受体的激发光谱必须有重叠；供体和受 体之间迁移偶极子的方向必须平行。
Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)
Fluorescence Absorbance
细胞水平检测
细胞水平检测
均相检测
异相检测
微生物检测 存活检测
哺乳动物 细胞检测
放射性检测
非放射性检测
过滤方法检测 放射性检测 生长/生长 抑制检测 非放射性功能检测 双杂交检测 报告基因检测 报告基因检测 混合检测 细胞毒性和细 胞增殖检测 放射免疫
ELISA 检测
荧光成像检测(FLIPR)
贴壁细胞或悬浮细胞中Fluo-3的荧光强度，间接反 映钙离子的浓度。在FLIPR实验中，可以用96孔或 384孔板对多个样品同时检测，测定荧光强度的过程 仅需1秒。可进行钙离子内流的动力学检测。
通过显色反应、荧光、化学发光以及同位素检测 技术测量生物反应的终点。
体外生化检测
体外生化检测
均相检测
异相检测
放射性检测 SPA 微粒
非放射性检测
放射性检测
非放射性检测
显色反应检测 吸收光检测
过滤方法检测 吸收方法检测
ELISA 检测
SPA 微孔板 荧光检测 微粒方法检测 沉淀方法检测
放射免疫
显色反应 (Photometry)
TM
捕获生物素标记组分
蛋白水解酶
3.
Biotin
Fluores
Biotin
Fluores
加入抗生物素链菌素测定荧光偏振
常用的蛋白水解酶检测方法
蛋白水解酶
4. Dabcyl
EDANS
Dabcyl
EDANS
测定EDANS荧光强度
蛋白水解酶
5.
Biotin
CY5
Biotin
CY5
加入抗生物素链菌素-APC测定 从Cy5到APC的共振能量转移
The Evolution of HTS
高通量筛选
• • • • 快速----每天筛选上万药次 微量----筛选样品需要量为微克级 灵敏----准确判断筛选样品的活性和选择性 经济----筛选费用低
常规筛选和高通量筛选
高通量筛选
常规筛选
高通量筛选的四个要素
HTS
数据处理 样品制备 自动化 模型建立
以酶为靶点
以酶为靶点进行的高通量筛选的优化及标准化涉及 以下几个步骤：
– – – – – 确定反应条件（如缓冲液、pH、温度） 天然或合成的底物的确定 酶动力学 信号窗口的评价 对已知抑制剂的反应情况
底物转变为产物后，分别使用显色反应、荧光或放 射性化学的方法等。适用的靶点不仅包括蛋白酶、 激酶和磷酸酯酶，也包括其它酶类，如DNA连接酶和 解旋酶。
R=Ph,CH3
O HS NO2 CO2H
R N H OH O
+
O2N HO2C
S S
=412nm
荧光强度 (Fluorescence Intensity)
7-amino-4-methylcoumarin rhodamine 110 resorufin
Fluorogenic Peptide Substrate
• • • • • • • Membrane Receptors Enzymes Hormones and Factors Ion Channels DNA Nuclear Receptors Unknown 45% 28% 11% 5% 2% 2% 7%
N = 483
J. Drews, Science (2000) 287:1962
要素一：高通量筛选模型建立
针对某一特定靶点，设计一种生物活性检测方法并
使之适用于高wenku.baidu.com量筛选。
选择高通量筛选的靶点
来源于基础科学对于一种疾病进行细致研究后的理
解和发现。根据这些结果，我们可以选择其中关键 的生物效应环节进行干预。这些靶点包括受体、酶、 激素、因子、离子通道和蛋白间的相互作用等。
Current Drug Targets
AlphaScreen for PIP3
Excitation 680 nm
O2
Emission 520-620 nm
Biotinylated PI(3,4,5)P3 analog anti-GST conjugated Acceptor Beads GST-tagged PIP3 Binding Protein Streptavidin-coated Donor Beads
常用的磷酸酯酶检测方法
33
PO43-
3.
Biotin
磷酸酯酶 Biotin + Free 33PO43-
抗生物素链菌素包被的SPA微粒或Flash platesTM捕获生物素标记组分或磷酸纤 维素板捕获磷酸化组分
PO43-
磷酸酯酶
4.
Biotin
Biotin
+ Free PO43-
应用孔雀绿染料检测游离 PO43-
靶点确证
• • • • • • • Expression phenotype ? Mutant ? Antisense treatment ? Antibody treatment ? RNAi ? Knockout / knockin ? Inhibitor treatment ?
克隆
PCR、RT-PCR方 法从cDNA文库、 EST克隆、组织和 细胞的总RNA中 得到关键靶基因
荧光偏振 (Fluorescence Polarization)
偏振光 快速旋转 方向随机 低的 FP信号
偏振光
生物大分子
强的 FP 信号
旋转减慢，偏振光 方向集中在偏振面上
FP
Theoretical FP Behavior of a Series of Fluorescent Dyes As a Function of MW
S
H2 N O
N O N H NO2
MetAP
HN O N H NO2
Met
ProAP
N H OH O
maxnm
+
H2 N
NO2
显色反应方法检测MetAP活性
S O H2N O S N H R MetAP OH O Met HS O N H R OH O
O2N HO2C
S S
NO2 CO2H
化合物资源
药物发现 DRUG DISCOVERY
1.药物先导化合物的发现
2.药物先导化合物的结构优化
药物候选化合物
1. 临床前研究 2. 临床研究
药物开发 DRUG DEVELOPMENT
新 药 研 究 的 两 个 阶 段
天然产物 化学合成 组合化学
—药物发现的关键环节
高通量筛选 技术
—高新技术集中的焦点
Fluorogenic (Quenched) Substrate
蛋白水解酶
Dabcyl
EDANS
Dabcyl
EDANS
测定EDANS荧光强度
FRET
Example of use of FRET in a protease assay
Matayoshi et al., Science 247 954 (1990)
亚克隆
大肠杆菌表达系 统 酵母表达系统 昆虫表达系统
大规模表达、 纯化、复性， 得到纯净重组 蛋白
分子水平筛选模型建立流程
N O O H N O N H S O O H N N H O O OEt
检测方法的确 定、优化及高 通量筛选模型 的建立
光吸收
HS O
COOH O2N HOOC S S NO2
COOH S NO2
H N
O N H OEt O
时间
E412nm =13,600 M1cm-1
模型设计
• 体外生化检测
–通常通过体外生化检测方法进行筛选的靶点包括酶、
受体、蛋白与蛋白的相互作用等
• 细胞水平的检测
–主要用于信号传导通路相关的靶点（包括受体、离子 通道）以及为发现抗生素设计的筛选模型
O R N H No2 O R O S N H R' E O HS N H R'
O2N
SS
NO CO2 H
2
E
HO2C
O No2 H2N 405nm=1.06×104 M-1cm-1 HS NO2 CO2H 412nm=1.4×104 M-1cm-1
+
O 2N HO2C
S S
N H
R'
显色反应方法检测MetAP活性
时间分辨荧光共振能传递 （Time Resolved FRET）
LANCE Assay for Kinase
LANCE Assay for Transferase and Nuclear receptor
LANCE Assay for Protease and Helicase
AlphaScreen