同位素标记方法-蛋白质组学

（1）高效性：SILAC是体内标记技术，标记效率可高达100%； ）高效性： （2）定量精确：线性范围广，降低由于样品制备不同而造成的实验内差异； ）定量精确： （3）高通量、灵敏度高：可同时鉴定并定量数百至数千种蛋白质，且检可测 ）高通量、灵敏度高： 测到纳克级水平； （4）相容性：可以对多种在DMEM或RPMI 1640培养基中能够培养的细胞 ）相容性： 或细菌中表达的蛋白进行标记； （5）灵活性：在缺乏L-赖氨酸和L-精氨酸的培养基中添加同位素标记的这两 ）灵活性： 种氨基酸，操作方便。
随着细胞培养的传代，细胞种原有的”轻“型蛋白质逐渐被”重“型蛋白质蛋白质代替
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代谢标记法—SILAC
技术优势——目前比较蛋白质组学最先进方法 技术优势——目前比较蛋白质组学最先进方法 ——
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化学标记法—iTRAQ
iTRAQ技术服务流程： iTRAQ技术服务流程： 技术服务流程
iTRAQ法。 1：样本经过不同处理后，提取蛋 白质; 2：蛋白质经过还原，封闭后胰蛋 白酶酶切; 3：肽段混合物分别用不同的iTRAQ 标记; 4：等量混合各种不同iTRAQ标记好 的肽段; 5：MS/MS质谱检测及分析。
缺点： 缺点：
（1）iTRAQ几乎可以标记所有的蛋白质，因此样本的污染对结果有影响。 （2）iTRAQ标记反应体系中有机体积高达60%以上，蛋白质非常容易发生沉淀而损失。
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常见同位素标记比较
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化学标记法—iTRAQ
简介： 简介：
iTRAQ试剂是可与氨基酸末端氨基及赖氨酸侧链氨基连接的胺标记同重元素。在质谱图 中，任何一种iTRAQ试剂标记不同样本中的同一蛋白质表现为相同的质荷比。 在串联质谱 中，信号离子表现为不同质荷比(113-119，121)的峰，因此根据波峰的高度及面积，可以 鉴定出蛋白质和分析出同一蛋白质不同处理的定量信息。
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化学标记法—iTRAQ
与传统双向凝胶电泳技术相比较，iTRAQ技术主要特点： 与传统双向凝胶电泳技术相比较，iTRAQ技术主要特点： 技术主要特点
（1）灵敏度高：检测限低，可检测出低丰度蛋白， （2）分离能力强、分析范围广、高通量：可同时对8个样本进行分析，对膜蛋白、疏 水蛋白等DIGE技术不能检测的蛋白进行标记，同时可以标记修饰后的氨基酸。 （3）结果可靠：由于报告离子是小分子物质，因此在质谱中很容易与其他肽段片段 离子区别，保证了定量的准确性。； （4）自动化程度高：液相与质谱连用，自动化操作，分析速度快，分离效果好。 （5）可绝对定量：在样本中加入iTRAQ试剂标记的已知量的标准蛋白，可以对样本中 的蛋白质进行绝对定量研究
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代谢标记法—SILAC
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代谢标记法—SILAC Labelin corporation
稳定同位素标记
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稳定同位素标记
代谢标记法： 代谢标记法：
在培养基中添加 N或其他同位 15 2 素氨基酸（ C或 H)的氨基酸，细胞 经过若干代培养后，蛋白质将完全被 同位素标记，等量混合标记与没有标 记同位素的样本、液相色谱和SDS-PA GE的分离，然后进行质谱鉴定和定量。
化学标记法—ICAT
ICAT法的缺点： （1）它不能用于标记不含半胱氨酸或半胱氨酸含量低的蛋白质。 （2）ICAT分子量相对较大（约500Da），与蛋白质连接后可能会造成分子 的空间位阻 （3）ICAT分子量相对较大（约500Da），由于在MS分析中标签仍保留在每 个肽上，使得在碰撞诱导解吸（CID)条件下，很容易被片段化，那么标签特 异化的片段离子就会使串联质谱分析标记肽段的过程复杂化， （4） ICAT分子量相对较大（约500Da），这对小肽而言是一个较大的修 饰物，会增加数据库搜索的复杂性 （5）标记时通常需要延长时间来保证ICAT与蛋白质充分结合，这可能会 造成赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸发生氨基酸局部衍化。 （6）与原子结合的硫醚键化学稳定性较低，可能会自发发生β-消除反应 使部分标签断裂。
化学标记法： 化学标记法：
（1）ICAT法 （2）iTRAQ法
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代谢标记法— N标记法
简介： 简介： 15 在培养基中添加 N，细胞经过若干代培养后，蛋白质将完全被同位素标记，等量混 合标记与没有标记同位素的样本、液相色谱和SDS-PAGE分离，质谱鉴定和定量。 根据质谱谱图中成对峰的面积之比可判断出同一肽段在不同样品中的含量变化，根 据二级谱图对肽段进行序列测定从而鉴定蛋白质。 优点： 优点： 15 高效性： N标记法是体内标记技术，标记效率可高达95%； 重现性：降低由于样品制备不同而造成的实验内差异； 15 灵活性：在培养基中添加同位素标记 N ，操作方便。 缺点： 缺点： 14 15 （1）只有已知蛋白质的氨基酸序列，才可以对 N/ N标记的蛋白质或肽段的相应质 量位移进行预测。 15 14 15 （2）由于使用的 N培养基纯度>96%，无法完全置换 N,所以 N标记的肽段在质谱中 会有额外的同位素峰。
iTRAQ 结构
iTRAQ包括三部分：报告部分、肽反应部分、平 衡部分。 1、报告部分：有八种，因此iTRAQ可同时标记8 组样品。 2、肽反应部分：能与肽N端及赖氨酸侧链发生共 价连接而标记上肽段，几乎可以标记所有蛋白质。 3、平衡部分：保证iTRAQ标记的同一肽段的质荷 比相同。
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化学标记法—ICAT
A: ICAT试剂结构，包括3个部分， SH反应集团， biotin标签，同位素臂， 试剂具有两种形式：重型（含8个氘） 和轻型（不含氘） B: ICAT标记定量技术流程，来源不同 处理的蛋白质分别用重型ICAT试剂和 轻型ICAT试剂标记，标记后等量混合， 胰蛋白酶酶切，亲和纯化得到ICAT标 记的多肽，质谱分析，依据MS质谱峰 图强度进行定量，MS/MS鉴定肽段。
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化学标记法： 化学标记法：
在收集蛋白质样品后，利用化学 反应在蛋白质或肽段的特殊位点引入 同位素标签，等量混合标记与没有标 记同位素的样本、液相色谱和SDS-PA GE的分离，然后进行质谱鉴定和定量。
常见的同位素标记技术
代谢标记法： 代谢标记法：
（1）15N标记法 （2）细胞培养中含有稳定同位素的氨基酸标记法（SILAC)
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代谢标记法—SILAC
简介： 简介：
SILAC即细胞培养条件下 稳定同位素标记技术，在细胞 培养时，采用含有轻、中、重 同位素型必需氨基酸的培养基 进行细胞培养，细胞经传代培 养若干代后，蛋白质将被同位 素稳定标记，等量混合标记的 蛋白质后分离和质谱鉴定，根 据一级质谱图中三个同位素型 肽段的面积比较进行相对定量 和二级谱图对肽段进行序列测 定从而鉴定蛋白质。