8目的基因的克隆
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• 插入片段长度大小鉴定 质粒抽提、酶切；PCR
• 插入片段方向性鉴定 可以选择基因内部切点进行不对称酶切
• DNA序列测定
2020/5/14
荧光质粒转染观察
2020/5/14
胞和在细胞中的复制。 ➢ 易从宿主细胞中分离纯化出来， 便于重组操作。 ➢ 有筛选标志，当其进入宿主细胞、或携带着外源序列进入宿主细胞都
能容易被辨认和分离出来。便于克隆操作。
• 常用的载体有质粒、噬菌体和病毒等
2020/5/14
重组 DNA 技术的一般流程
➢ 目的DNA的获得 ➢ 目的DNA与载体的连接 ➢ 重组子导入受体细胞 ➢ 重组子的筛选和鉴定
➢ 特性：连接粘端的效率远高于平端。 ➢ 策略1：. 首选不匹配粘端
2. 次选匹配粘端，载体脱磷 3. 平端连接，延长时间，提高酶量
2020/5/14
平端连接图示
2020/5/14
匹配粘端连接图示
2020/5/14
不匹配粘端连接图示
2020/5/14
连接反应的建立
➢ 连接反应的温度：
❖ 粘性末端，按A-T，G-C含量计算，±5℃。 ❖ 如 Pst I（CTGCA↓G，12℃ ），EcoRI（G↓AATTC，8℃）。 ❖ 平末端，如EcoRⅤ（GAT↓ATC），可在室温进行，不超过30℃
➢ 连接反应在灭菌的0.5ml离心管中进行。15 l体积反
应体系中：
加ddH2O使终体积为 Liner vector
15 l 50-100 ng
Target gene fragment
15- 30 ng
10×Ligase Buffer (已含有ATP) T4 DNA Ligase
1.5 l 1.O l
2020/5/14
实验一:pEGFP-NGF质粒载体的构建
2020/5/14
• NGF 基因的克隆(T-A克隆)
NGF-sense: NGF-antisense:
a GAGCTC aagatgctgtgcctcaagccagt at GGGCCC gtctagatcc agagtgtctg
6
5
2020/5/14
pEGFP 荧光质粒表达载体
2020/5/14
质粒DNA的酶切反应结果
质粒 M 酶切反应
M 酶切反应
2020/5/14
pEGFP
pT-NGF
酶切产物凝胶回收操作步骤
（Gel Extraction Kit）
➢ 仔细切下含DNA的凝胶，置一称重的1.5ml离心管中。称重。 ➢ 按300lS1溶液/100mg凝胶加入的比例加入S1溶液，置50℃水浴10分钟，
➢ 轻轻混匀，稍加离心, 14-16℃或4℃,O/N 。
2020/5/14
重组子转入受体细胞
➢ 体外重组的DNA引入受体细胞 ➢ 感受态:受体细胞处于易于接受外源 DNA
的状态 ➢ 原理:（1）遗传物质的传递
（2）受体菌的选择与改造
2020/5/14
重组质粒的酶切鉴定
2020/5/14
重组子的鉴定
，酶的用量要比粘性末端加大10-100倍 。
➢ DNA量：
❖ 摩尔数之比 载体:目的 DNA ＝ 1 : ( 1~3 )
载体摩尔数
目标基因片段碱基数×载体重量
目标DNA摩尔数
目标基因片段重量×载体碱基数
2020/5/14
载体和目标基因的连接反应
➢ 如未定量可以按回收效率75％计算DNA浓度，按载体与 目的基因摩尔数比1:3进行连接。
使凝胶完全溶化，每2分钟颠倒混匀一次。 ➢ 将溶化后的凝胶溶液移入吸附柱，置收集管中，9000g×30秒，倒掉收集
管中的液体，再将吸附柱放入同一收集管中。 ➢ 在吸附柱中加入500l W1溶液，9000g×15秒，倒掉收集管中的液体，再
将吸附柱放入同一收集管中。重复一次洗柱。 ➢ 将吸附柱放入同一收集管中。9000g×1分钟。 ➢ 将吸附柱放入一新1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入30lddH2O，静置1
分钟，9000g×1分钟。备用。
2020/5/14百度文库
2020/5/14
重组子的筛选
• 耐药性基因 外源质粒赋予宿主抗生素抗性
• 蓝白斑筛选（互补现象） lacZ＋ plasmid 和 M15△ cell strain
2020/5/14
关于连接酶
➢ 定义：ATP存在下，在3’OH和5’ P之间形成磷酸二酯 键。
基因克隆的一般流程
PCR RT-PCR
基因的获得
连接
载体
准备感受态细胞
转化 重组子筛选
下游工作
2020/5/14
载体的选择
• 基因工程载体一般要求：
➢ 能在宿主细胞中复制繁殖，有较高的自主复制能力。 ➢ 易进入宿主细胞，进入效率越高越好。 ➢ 合适的多克隆位点（MCS）可接受外源片段，且不影响其进入宿主细
• 插入片段方向性鉴定 可以选择基因内部切点进行不对称酶切
• DNA序列测定
2020/5/14
荧光质粒转染观察
2020/5/14
胞和在细胞中的复制。 ➢ 易从宿主细胞中分离纯化出来， 便于重组操作。 ➢ 有筛选标志，当其进入宿主细胞、或携带着外源序列进入宿主细胞都
能容易被辨认和分离出来。便于克隆操作。
• 常用的载体有质粒、噬菌体和病毒等
2020/5/14
重组 DNA 技术的一般流程
➢ 目的DNA的获得 ➢ 目的DNA与载体的连接 ➢ 重组子导入受体细胞 ➢ 重组子的筛选和鉴定
➢ 特性：连接粘端的效率远高于平端。 ➢ 策略1：. 首选不匹配粘端
2. 次选匹配粘端，载体脱磷 3. 平端连接，延长时间，提高酶量
2020/5/14
平端连接图示
2020/5/14
匹配粘端连接图示
2020/5/14
不匹配粘端连接图示
2020/5/14
连接反应的建立
➢ 连接反应的温度：
❖ 粘性末端，按A-T，G-C含量计算，±5℃。 ❖ 如 Pst I（CTGCA↓G，12℃ ），EcoRI（G↓AATTC，8℃）。 ❖ 平末端，如EcoRⅤ（GAT↓ATC），可在室温进行，不超过30℃
➢ 连接反应在灭菌的0.5ml离心管中进行。15 l体积反
应体系中：
加ddH2O使终体积为 Liner vector
15 l 50-100 ng
Target gene fragment
15- 30 ng
10×Ligase Buffer (已含有ATP) T4 DNA Ligase
1.5 l 1.O l
2020/5/14
实验一:pEGFP-NGF质粒载体的构建
2020/5/14
• NGF 基因的克隆(T-A克隆)
NGF-sense: NGF-antisense:
a GAGCTC aagatgctgtgcctcaagccagt at GGGCCC gtctagatcc agagtgtctg
6
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2020/5/14
pEGFP 荧光质粒表达载体
2020/5/14
质粒DNA的酶切反应结果
质粒 M 酶切反应
M 酶切反应
2020/5/14
pEGFP
pT-NGF
酶切产物凝胶回收操作步骤
（Gel Extraction Kit）
➢ 仔细切下含DNA的凝胶，置一称重的1.5ml离心管中。称重。 ➢ 按300lS1溶液/100mg凝胶加入的比例加入S1溶液，置50℃水浴10分钟，
➢ 轻轻混匀，稍加离心, 14-16℃或4℃,O/N 。
2020/5/14
重组子转入受体细胞
➢ 体外重组的DNA引入受体细胞 ➢ 感受态:受体细胞处于易于接受外源 DNA
的状态 ➢ 原理:（1）遗传物质的传递
（2）受体菌的选择与改造
2020/5/14
重组质粒的酶切鉴定
2020/5/14
重组子的鉴定
，酶的用量要比粘性末端加大10-100倍 。
➢ DNA量：
❖ 摩尔数之比 载体:目的 DNA ＝ 1 : ( 1~3 )
载体摩尔数
目标基因片段碱基数×载体重量
目标DNA摩尔数
目标基因片段重量×载体碱基数
2020/5/14
载体和目标基因的连接反应
➢ 如未定量可以按回收效率75％计算DNA浓度，按载体与 目的基因摩尔数比1:3进行连接。
使凝胶完全溶化，每2分钟颠倒混匀一次。 ➢ 将溶化后的凝胶溶液移入吸附柱，置收集管中，9000g×30秒，倒掉收集
管中的液体，再将吸附柱放入同一收集管中。 ➢ 在吸附柱中加入500l W1溶液，9000g×15秒，倒掉收集管中的液体，再
将吸附柱放入同一收集管中。重复一次洗柱。 ➢ 将吸附柱放入同一收集管中。9000g×1分钟。 ➢ 将吸附柱放入一新1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入30lddH2O，静置1
分钟，9000g×1分钟。备用。
2020/5/14百度文库
2020/5/14
重组子的筛选
• 耐药性基因 外源质粒赋予宿主抗生素抗性
• 蓝白斑筛选（互补现象） lacZ＋ plasmid 和 M15△ cell strain
2020/5/14
关于连接酶
➢ 定义：ATP存在下，在3’OH和5’ P之间形成磷酸二酯 键。
基因克隆的一般流程
PCR RT-PCR
基因的获得
连接
载体
准备感受态细胞
转化 重组子筛选
下游工作
2020/5/14
载体的选择
• 基因工程载体一般要求：
➢ 能在宿主细胞中复制繁殖，有较高的自主复制能力。 ➢ 易进入宿主细胞，进入效率越高越好。 ➢ 合适的多克隆位点（MCS）可接受外源片段，且不影响其进入宿主细