大鼠血清外泌体不同提取方法的比较
外泌体提取的方法
外泌体提取的方法外泌体是一种小型的胞外囊泡，它们由细胞释放出来，带有许多生物分子，如蛋白质、RNA和DNA等。
这些外泌体在很多生物体中都被发现，包括植物、动物和微生物等，而研究它们已经成为了一个热门课题。
因此，外泌体提取方法的研究也愈发重要。
1. 已有的外泌体提取方法目前已经开发出了几种外泌体提取方法，包括差速离心、密度梯度离心和超滤等。
这些方法每一种都有其优点和限制。
下面将分别介绍这三种方法。
差速离心法这是当前最常用的外泌体提取方法。
差速离心法利用一个多步骤的过滤和离心过程来提取外泌体。
此方法通过圆盘刷子离心除去大的细胞残留和细胞碎片，然后再通过速度梯度离心 Pellet 小径的微粒（包括外泌体）。
最终，被Pellet收集的微粒经过洗涤和再次离心以获得纯化的外泌体。
但这种方法也存在一些问题。
例如：外泌体含量极小，容易堵塞过滤器，处理时间也较长等。
密度梯度离心法这种方法是通过使用梯度浓度离心的离心管来纯化和分离外泌体。
这种方法可以强制微粒沉降到其密度梯度离心中与之匹配的密度位置。
密度高的梯度位置收集纯化的外泌体。
但是，密度梯度离心法也存在一些限制，由于梯度的浓度特性，产生相当多的上清液需要处理。
超滤法超滤法可以使用聚酰胺膜筛，把自然和添加的物质、基质等从水或反向微乳液中移除。
超滤法是一种最新的外泌体提取方法。
此方法是通过微孔膜以外泌体大小排除液体中的大分子物质，而留下外泌体和其他小分子在膜上。
最后，外泌体可以从膜上收集。
但是此方法也存在缺陷，需要更昂贵的设备，如超滤膜和超滤器等。
2. 未来发展方向虽然以上方法都有其优点和缺陷，但随着技术的发展和研究的深入，可能会出现新的外泌体提取方法，以更快捷、更准确、更方便的方式提取外泌体。
例如，利用氮氧化物处理方法，可以在不使用离心机和过滤器的情况下，快速提取外泌体。
这种方法可以在较少的研究时间内提取足够数量的外泌体。
随着技术的不断发展，人们希望设计出更加高效的方法，以便更好地应用于外泌体的研究中，更广泛地使用这些方法，并更好地理解外泌体的分子机制。
外泌体提取方法
外泌体提取方法外泌体是一种细胞分泌的小囊泡，它们在细胞间传递信息，参与调控细胞的生理活动，对于细胞间的相互作用和信号传导起着重要的作用。
因此，外泌体的提取方法对于细胞生物学和临床医学研究具有重要意义。
下面将介绍几种常用的外泌体提取方法。
1. 超速离心法。
超速离心法是目前常用的外泌体提取方法之一。
首先，将细胞培养液进行低速离心，去除细胞残渣和细胞碎片，然后将上清液进行高速离心，将外泌体沉淀下来。
最后，用洗涤液洗涤沉淀物，得到纯净的外泌体。
这种方法操作简单，提取效率高，适用于大规模提取外泌体。
2. 超滤法。
超滤法是利用超滤膜对细胞培养液进行过滤，将外泌体从培养液中分离出来。
这种方法不需要离心步骤，操作简便，适用于小规模外泌体提取。
但是需要注意的是，选择合适的超滤膜孔径和分子量截留率，以确保外泌体能够有效地被提取出来。
3. 密度梯度离心法。
密度梯度离心法是利用不同密度的梯度液体将外泌体与其他细胞成分分离开来。
首先，将细胞培养液加入密度梯度离心管中，然后进行超速离心，外泌体会沉淀在不同密度的梯度液体中。
通过调整离心参数，可以将外泌体从其他细胞成分中有效地提取出来。
这种方法提取的外泌体纯度较高，适用于对外泌体纯度要求较高的实验。
4. 免疫亲和法。
免疫亲和法是利用外泌体表面蛋白与特定抗体的结合来提取外泌体。
首先，将抗体固定在亲和树脂上，然后将细胞培养液与亲和树脂进行免疫反应，外泌体会与抗体结合，然后通过洗涤等步骤将外泌体从亲和树脂上提取出来。
这种方法可以选择特定的外泌体蛋白进行提取，适用于对外泌体特定蛋白的研究。
总结。
外泌体的提取方法多种多样，可以根据实验的需要选择合适的方法。
在进行外泌体提取时，需要注意操作规范，避免外泌体的污染和损失。
同时，根据实验要求选择合适的提取方法，可以提高外泌体的提取效率和纯度，为后续的实验研究提供可靠的样品。
希望以上介绍的外泌体提取方法能够对您的研究工作有所帮助。
外泌体提取鉴定
外泌体提取鉴定1. 介绍外泌体（Extracellular Vesicles，EVs）是一种由细胞分泌的小型膜囊泡，具有重要的生物学功能。
它们主要通过胞吐（exocytosis）的方式释放到细胞外，可以携带多种生物活性分子，如蛋白质、核酸和脂质等。
外泌体的提取鉴定是一项关键的研究技术，可以帮助我们了解外泌体的组成、功能以及其在疾病诊断和治疗中的潜在应用。
2. 外泌体提取方法外泌体的提取方法有多种，常用的方法包括超速离心法、密度梯度离心法、尺寸排除柱法等。
2.1 超速离心法超速离心法是最常用的外泌体提取方法之一。
该方法通过多次离心步骤，逐渐提高离心速度，使外泌体沉淀。
离心步骤通常包括低速离心、高速离心和超高速离心。
低速离心一般在300g-2000g的离心力下进行，用于去除细胞碎片和大颗粒物质。
高速离心一般在10000g-20000g的离心力下进行，用于沉淀较大的外泌体。
超高速离心一般在100000g以上的离心力下进行，用于沉淀较小的外泌体。
2.2 密度梯度离心法密度梯度离心法利用外泌体与离心液中不同密度的物质在离心过程中的分层原理，实现外泌体的提取。
常用的密度梯度离心液包括葡萄糖、蔗糖和乳酸等。
离心过程中，外泌体会在离心液中沉淀到特定的密度层，然后可以通过离心收集到外泌体。
2.3 尺寸排除柱法尺寸排除柱法是一种基于外泌体粒径的提取方法。
该方法利用尺寸排除柱的特殊结构，可以将大颗粒物质和细胞碎片滞留在柱中，而将外泌体通过柱床，实现外泌体的提取。
尺寸排除柱法操作简便，提取效果较好，适用于小样本量的外泌体提取。
3. 外泌体鉴定方法外泌体的鉴定方法主要包括电子显微镜观察、蛋白质分析、核酸分析和功能鉴定等。
3.1 电子显微镜观察电子显微镜是观察外泌体形态和结构的重要工具。
通过电子显微镜观察，可以看到外泌体的膜结构、大小和形状等特征。
电子显微镜观察可以直观地确认提取到的颗粒是否为外泌体。
3.2 蛋白质分析蛋白质分析是外泌体鉴定的重要手段之一。
外泌体提取方法比较
外泌体提取方法比较外泌体是一种细胞外膜囊泡，通过一系列特殊的细胞分泌机制，从宿主细胞中释放出来。
外泌体中富含多种生物活性分子，如蛋白质、核酸、脂质和代谢产物等，对细胞间信息传递、免疫反应、炎症调节等生理和病理过程具有重要作用。
因此，外泌体的提取和分离成为研究其功能和应用的重要步骤。
目前常用的外泌体提取方法包括差速离心、超滤、密度梯度离心、覆膜及抗体磁珠法等。
以下将对这些方法的原理、优缺点进行详细介绍。
1.差速离心法：差速离心是一种简单且常用的外泌体提取方法。
它是通过逐步增加离心力，将细胞碎片和大颗粒物质从上清液中分离出来，最后得到外泌体的方法。
优点是操作简单、效果可靠，适用于大规模外泌体提取。
缺点是纯度较低，提取得到的外泌体中可能夹杂有其他细胞碎片和蛋白质聚集体。
2. 超滤法：超滤法是利用滤膜孔径选择性筛选颗粒物质的方法。
通常使用滤孔直径为20-100 nm的滤膜进行过滤，将大颗粒物质和细菌滤出，实现外泌体的提取。
优点是简便快速，可以得到较高纯度的外泌体。
缺点是容易因滤膜堵塞导致提取效果不佳，并且只能得到一部分外泌体。
3.密度梯度离心法：密度梯度离心法是根据物质密度的差异进行分离的方法。
通常使用等体积或等体积百分比的梯度溶液（如葡萄糖或蔗糖）进行离心，不同密度的物质会在梯度中分层沉淀。
外泌体的密度较低，往往在低密度梯度中聚集。
优点是可以分离得到高纯度的外泌体，并且可以细致分离不同类型的外泌体。
缺点是操作复杂，耗时较长。
4.覆膜法：覆膜法是指通过将培养基中的细胞和碎片离心去除后，直接在细胞上清液上方加入覆盖材料（如覆膜、多孔膜等），使外泌体通过覆盖材料进入上清液的方法。
优点是操作简单，不需要额外的离心步骤。
缺点是提取得到的外泌体纯度较低，可能夹杂有其他颗粒物质。
5.抗体磁珠法：抗体磁珠法是利用表面覆盖特定抗体的磁性微珠，通过与外泌体表面标记物质的特异性结合来实现外泌体的提取。
优点是提取效果稳定，纯度较高，可以选择性地提取一些类型的外泌体。
外泌体提取方法比较
??外泌体（Exosome）发现于1986年，是一种直径约30~100nm的双层膜囊泡状结构小体，可由机体内多种细胞如免疫细胞、干细胞、心血管细胞、网织红细胞、血小板、神经细胞和肿瘤细胞等主动分泌产生，广泛分布于外周血、尿液、唾液、乳汁、腹水、羊水等体液中。
外泌体携带大量特异性的蛋白质（如细胞因子、生长因子）以及功能性的mRNAs、miRNAs等生物活性物质，在体内参与细胞通讯、细胞迁移、促血管新生和抗肿瘤免疫等生理过程，与多种疾病的发生和进程密切相关[1][2]。
由于外泌体的特殊结构和功能，使得它具有潜在的应用价值，一方面可以作为诊断多种疾病的生物指标，另一方面也可以作为治疗手段，未来有可能作为药物的天然载体用于临床治疗。
外泌体的分离纯化一直是科研工作者关注的问题，获得高纯度的外泌体对后续的研究至关重要。
据了解，目前人们多采用超速离心、免疫磁珠、超滤、沉淀或试剂盒等方法实现外泌体的提取分离：1、超速离心法（差速离心）超离法是最常用的外泌体纯化手段，采用低速离心、高速离心交替进行（如图所示），可分离到大小相近的囊泡颗粒。
超离法因操作简单，获得的囊泡数量较多而广受欢迎，但过程比较费时，且回收率不稳定（可能与转子类型有关），纯度也受到质疑；此外，重复离心操作还有可能对囊泡造成损害，从而降低其质量[3]。
2、密度梯度离心在超速离心力作用下，使蔗糖溶液形成从低到高连续分布的密度阶层，是一种区带分离法。
通过密度梯度离心，样品中的外泌体将在1.13-1.19g/ml的密度范围富集。
此法获得的外泌体纯度较高，但步骤繁琐，耗时。
3、超滤离心[4]由于外泌体是一个大小约几十纳米的囊状小体，大于一般蛋白质，利用不同截留相对分子质量(MWCO)的超滤膜对样品进行选择性分离，便可获得外泌体。
超滤离心法简单高效，且不影响外泌体的生物活性，是提取细胞外泌体的一种新方法。
4、磁珠免疫法外泌体表面有其特异性标记物（如CD63、CD9蛋白）[5]，用包被抗标记物抗体的磁珠与外泌体囊泡孵育后结合，即可将外泌体吸附并分离出来。
外泌体提取方法比较
外泌体提取方法比较外泌体（extracellular vesicle，EVs）是一类广泛存在于体液中的细胞外小囊泡，它们由细胞释放并包裹着细胞膜，可携带细胞成分如蛋白质、核酸、脂质等，具有重要的生物学功能。
因此，外泌体提取方法的研究和比较对于深入了解和应用外泌体具有重要意义。
目前常用的外泌体提取方法主要包括超速离心法、凝胶过滤法、免疫亲和法、磁珠法和化学法等，下面将对这些常用的方法进行比较。
超速离心法是提取外泌体最常用的方法之一，其主要步骤包括差速离心和超速离心。
由于外泌体的大小范围相对较小（30-150 nm），因此要通过不同的转速和不同的时间对样品进行逐步的离心，以获得纯化的外泌体。
超速离心法的优点是提取到的外泌体数量较多，但存在一定的缺点，如操作复杂、时间长、成本高以及无法彻底除去离心的其他细胞碎片。
凝胶过滤法是利用凝胶纤维通过外泌体的大小选择性提取外泌体。
它的优点是简单易行，不需要专门的设备和耗材，但提取到的外泌体数量较少，可能存在一定的纯度问题。
免疫亲和法是通过特异性抗体与特定外泌体表面标志物的结合，利用磁珠等载体进行外泌体的提取。
免疫亲和法的优点是操作简单、提取到的外泌体纯度较高，但需要进行专门的抗体标记和染色，成本较高。
磁珠法是利用具有亲和性的磁性材料提取外泌体。
这种方法具有操作简单、纯度较高的优点，但对于部分磁性材料的购买和使用有一定的限制。
化学法主要是利用有机溶剂和离子液体等化学方法来提取外泌体。
这种方法相对较新，属于非常规的提取方法之一、虽然其操作简便，但由于存在一定的化学毒性和对溶剂残留的担忧，目前该方法的应用还相对较少。
总的来说，不同的外泌体提取方法各有优缺点，具体选择哪一种方法需要根据实际需求进行评估。
超速离心法、凝胶过滤法和免疫亲和法是目前应用较广泛的方法，它们在纯度、操作简便和提取效率等方面各有优劣。
未来的研究可以探索新的、更高效的提取方法，以满足外泌体研究的不断需求。
两种提取细胞外泌体方法的比较
两种提取细胞外泌体方法的比较周昌娈;谭磊;谢军;丁铲【期刊名称】《中国动物传染病学报》【年(卷),期】2018(026)002【摘要】近期研究发现外泌体在很多生理病理过程中起着重要作用,因而外泌体已成为当前的科研热点.本研究从外泌体形态、标志蛋白的表达方面比较了HeLa细胞外泌体的两种常用提取方法,以期获得更有效地提取Hela细胞中的外泌体方法.利用电镜观察两种方法提取的外泌体形态;动态光散射(dynamic light scattering,DLS)测定外泌体颗粒大小及分布,蛋白印迹法(Western Blot,WB)检测外泌体标志蛋白CD63、CD81的表达.结果显示,差速离心法与PEG沉淀法所提外泌体都呈茶托样双层膜结构,直径约30~150 nm,无明显形态差异,外泌体标志蛋白正常表达,但PEG沉淀法要引入PEG,有可能影响外泌体生物活性,可见,差速离心法是一种更可靠的有效提取外泌体的方法.%Recent studies have found that exosomes play an important role in many physiological and pathological processes. Thus, exosomes have become a current research hotspot. We compared two common methods of extracting HeLa exosomes to obtain some reliable and effective exosomes. The morphology of exosomes extracted by differential centrifugation method and polyethylene glycol (PEG) precipitation method was observed by electron microscopy. The size and distribution of particles from the samples was detected by dynamic light scattering (DLS). The expression of the exosome marker protein,CD63 and CD81, was analyzed by Western blot. We found that exosomesextracted with differential centrifugation method and PEG precipitation method both have saucer like membrane structure, and their diameters are around 30~150 nm. There are no significant morphological differences between exosomes isolated with these two methods. The exosome marker proteins were normally expressed. Thus, compared with PEG precipitation method, differential centrifugation method could be a more reliable and effective method of extracting exosomes.【总页数】4页(P64-67)【作者】周昌娈;谭磊;谢军;丁铲【作者单位】中国农业科学院上海兽医研究所,上海200241;中国农业科学院上海兽医研究所,上海200241;西北民族大学,兰州730030;中国农业科学院上海兽医研究所,上海200241【正文语种】中文【中图分类】Q813【相关文献】1.人脐带间充质干细胞来源外泌体提取方法的比较 [J], 郭莹;王秀伟;牛玉虎;王莉;周楠;李佰一;王振东;张蘋;高亚杰;牛勃;2.两种人脐带间充质干细胞源外泌体分离方法的比较 [J], 刘高米洋;潘兴华;和法莲;陆容;刘菊芬;何洁;王红阳3.超速离心法与QIAGEN膜亲和柱法提取前列腺癌细胞培养上清外泌体的方法学比较 [J], 范维肖;刁艳君;马越云;郝晓柯4.两种提取小鼠血清来源外泌体方法的比较 [J], 孙有良; 王宇童5.肝星状细胞来源外泌体不同提取方法的比较 [J], 黄小莉; 赵颖; 刘莹莹; 丛敏; 李长英; 王晓凡; 刘琳; 刘天会; 王萍; 王宇童因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
血清外泌体提取方法(一)
血清外泌体提取方法(一)血清外泌体提取方法1. 超速离心法•使用超速离心机将血清样本离心，离心速度一般在10,000 g以上。
•离心后，将上清液转移到新的离心管中，避免沉淀物的干扰。
2. 滤膜法•将血清样本通过0.22微米的滤膜过滤器进行过滤，以去除大部分细胞和碎片。
•过滤后的上清液就是富含外泌体的样本，可以用于进一步提取和研究。
3. 差速离心法•使用差速离心机，先进行低速离心，去除大部分细胞和碎片。
•然后将上清液转移到新的离心管中，进行高速离心，富集外泌体。
•最后将上清液转移至新的离心管中，以去除杂质，得到纯净的外泌体样本。
4. 密度梯度离心法•制备不同密度梯度的离心液，将血清样本与离心液混合。
•使用超速离心机进行离心，外泌体会在不同密度梯度的离心液层中分布。
•取出目标密度层中的外泌体，进行后续研究。
5. 抗体亲和法•利用特定的抗体对外泌体表面的蛋白进行识别和结合。
•通过结合特定的抗体，可以将外泌体与其他细胞碎片和蛋白质区分开来。
•进一步使用离心等方法，将外泌体富集提取。
6. 生物素链霉亲和法•将生物素链霉素与其他蛋白结合，并加入血清样本中。
•生物素链霉素会特异性地结合外泌体表面上的生物素结合受体。
•利用生物素链霉素的亲和性，将外泌体富集提取出来。
7. 电泳法•使用凝胶电泳将血清样本进行分离。
•外泌体会在凝胶中迁移，形成独特的带状图案。
•通过裁剪目标带进行提取和研究。
以上是一些常用的血清外泌体提取方法，每种方法都有其优缺点和适用范围。
在选择方法时，需要根据实验目的和具体情况进行综合考虑。
8. 静电荧光法•利用外泌体表面的电荷性质，通过静电作用将外泌体富集提取。
•常用的静电荧光染料有山萸苷、草酸黄等，可与外泌体表面的负电荷相互吸引。
•通过荧光信号的增强，可以富集和检测外泌体。
9. 残余血小板法•血浆中存在大量的残余血小板，这些血小板上富集有很多外泌体。
•使用低速离心法去除大部分细胞和碎片后，对残余血小板进行高速离心，获取外泌体样本。
血清外泌体提取方法
血清外泌体提取方法血清外泌体（extracellular vesicles, EVs）是细胞释放的一类小型膜囊泡，内含丰富的蛋白质、核酸和代谢产物，具有重要的生物学功能和临床应用价值。
为了从血清中提取血清外泌体，以下是十种常用的方法，并对每种方法进行详细描述：1. 超速离心法：将血清进行低速离心，去除细胞碎片和大的膜囊泡，然后再将上清液进行高速离心，获得血清外泌体。
2. 密度梯度离心法：将血清样品与密度梯度溶液混合，进行离心，血清外泌体会分布在不同密度的梯度区域，然后可以分层收集血清外泌体。
3. 尺寸排除色谱法：使用尺寸排除色谱柱来分离血清外泌体，根据外泌体的大小，使得外泌体能够通过或滞留在柱上，然后收集滞留在柱上的外泌体。
4. 抗体磁珠法：使用特定外泌体表面标记的抗体磁珠，在血清中捕获外泌体，并通过磁力分离的方法将外泌体与其他成分分离。
5. 商业试剂盒法：市面上有很多专门用于提取血清外泌体的商业试剂盒，这些试剂盒通常包含了提取和富集外泌体的试剂和相关操作步骤。
6. 过滤法：使用不同孔径的滤膜，将血清进行过滤，外泌体会在滤膜上滞留，然后收集滞留的外泌体。
7. 微流控芯片法：使用微流控芯片，通过微流体的操控来分离和富集外泌体。
8. 电泳法：将血清样品进行电泳，根据外泌体的电荷和尺寸差异，使其在电泳过程中迁移，并在特定位置收集外泌体。
9. 裂解法：以裂解细胞膜的方法来释放细胞内外泌体，然后通过离心等方法来获得纯净的血清外泌体。
10. 光学方法：利用光学原理和技术，如光操控、光拉曼等，来分离和富集外泌体。
这些方法各有优劣，选择哪种方法取决于实验室的具体需求和仪器设备的可用性。
提取血清外泌体的方法也是一个不断发展和改进的领域，未来可能会出现更多的提取方法和技术。
不同离心方法提取及鉴定精浆外泌体的效果比较
不同离心方法提取及鉴定精浆外泌体的效果比较郭文彬，张万松，杨诚，卞军，杨建昆，刘存东，亓涛，王春艳［摘要］目的超速离心法、ExoPerfect TM ⁃MU 法和PEG6000法比较提取精浆外泌体的应用报道较少。
文中旨在比较及鉴定超速离心法，ExoPerfect TM ⁃MU 法及PEG6000法提取的精浆外泌体，为外泌体的研究提供不同的选择方法。
方法收集2017年3月至7月南方医科大学南方医院检验中心30例正常志愿者的精浆样本。
随机平均分成3份，分别采用超速离心法，ExoPerfect TM ⁃MU 法及PEG6000法获取提取物，随后采用纳米颗粒跟踪分析仪分析其大小，透射电子显微镜观察其形态，蛋白印迹法检测其典型标志蛋白质。
结果超速离心法提取的精浆外泌体中CD63、TSG101含量[（3.29±0.22）、（0.84±0.03）]最多，其次分别是ExoPerfect TM ⁃MU 法[（3.25±0.17）、（0.75±0.02）]、PEG6000法[（2.62±0.06）、（0.54±0.10）]，差异有统计学意义（P <0.05）。
纳米颗粒跟踪分析仪结果提示MODE 曲线线性流畅，精浆外泌体直径大小较为集中,粒径峰值平均值分别为105、102、115nm ，差异无统计学意义（P >0.05）。
PEG6000法提取精浆外泌体的浓度、电镜下数量[（11.90±1.78）×108/mL 、（4.7±1.7）个]较超速离心法[（21.20±0.98）×108/mL 、（7.0±1.6）个]，ExoPerfect TM ⁃MU 法[（19.74±1.45）×108/mL 、（6.0±1.63）个]均明显降低（P <0.01）；ExoPerfect TM ⁃MU 法离心时间[（30±5）min]较超速离心法、PEG6000法[（140±20）、（120±10）min]明显缩短（P <0.001）。
不同血清量标本外泌体提取及微小RNA的检测结果比较
不同血清量标本外泌体提取及微小RNA的检测结果比较王倩倩;卢川;陈良;黄玉仙【摘要】本文旨在探讨Qiagen exoRNeasy Serum/Plasma试剂盒提取血清标本中外泌体所需的最适血清量.采用Qiagen exoRNeasy Serum/Plasma试剂盒分别对250、500、1000μL血清中的外泌体进行抽提,使用透射电子显微镜检测分离的外泌体大小和形态,蛋白质免疫印迹法检测外泌体蛋白标记CD63和TSG101的表达,实时荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测外泌体中微小RNA-122(microRNA-122,miR-122)的表达.结果显示,透射电子显微镜下可见血清外泌体呈圆形或椭圆形,直径30～150 nm,有完整的膜结构.蛋白免疫印迹法检测外泌体CD63和TSG101阳性.实时荧光定量PCR检测慢性乙型肝炎患者250、500、1000μL血清外泌体中miR-122表达量,与正常人相比,分别上调22.44、21.48、20.69倍(P=0.42).结果提示,在临床血清样本体积有限的情况下,采用Qiagen exoRNeasy Serum/Plasma试剂盒提取血清中外泌体,减少血清量至250μL也可达到所需实验目的.%The present paper aims to investigate the optimum amount of serum samples used to isolate exosomes by Qiagen exoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit . Exosomes were isolated by Qiagen exoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit from different gradient serumsamples ,including 250 μL ,500 μL ,1000 μL .The particle size and morphology of exosomes were measured by transmission electron microscopy . The expressions of exosomal surface protein markers CD63 and TSG101 were determined by Western blotting . The expression of microRNA-122 (miR-122) in exosomes was detected by real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction (PCR) .Serum exosomeswere circular or elliptic under the transmission electron microscope with diameters of 30-150 nm and they had intact membrane structure .Western blotting results showed that CD63 and TSG101 were positive in exosomes . The real-time fluorescent quantitative PCR results showed that when the initial serum volume was 250μL ,500 μL and 1000 μL ,the expression of miR-122 in chronic hepatitis B patients was up-regulated by 22 .44folds ,21 .48 folds and 20 .69 folds ,respectively compared with controls ( P= 0 .42 ) . It is suggested that a small amount of 250 μL serum could be used for isolation of exosomes by Qiagen exoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit ,when the clinical serum sample is limited .【期刊名称】《微生物与感染》【年(卷),期】2018(013)003【总页数】6页(P165-170)【关键词】慢性乙型肝炎;外泌体;微小RNA【作者】王倩倩;卢川;陈良;黄玉仙【作者单位】复旦大学附属公共卫生临床中心肝炎一科 ,上海201508;复旦大学附属华山医院感染科 ,上海200040;复旦大学附属华山医院感染科 ,上海200040;复旦大学附属公共卫生临床中心肝炎一科 ,上海201508【正文语种】中文1985年Pan等[1]首次发现，外泌体是哺乳动物网织红细胞成熟过程中分泌的直径为40～100 nm的膜性小囊泡，电子显微镜下呈茶托形或一侧凹陷的半球形。
外泌体分离鉴定实验技术介绍及选用策略
如果使用国产的生工出品PEG6000，生 工官网报价 500g 不足百元。
外泌体的不同分离方法对比
免疫沉淀
抗体或适配体
囊泡表面CD63、PS、 其他特殊蛋白等
外泌体下游研究技术 高通量分析——RNA高通量分析、蛋白质谱分析 过表达或敲低外泌体中的RNA或蛋白 靶细胞对外泌体的摄取 抑制外泌体的释放或摄取
外泌体研究——论文的套路
外泌体的不同分离方法对比
超速离心 起始量要大！一般 40~100mL培液起
水平转最好！ 不要倒！ 不要倒！ 不要倒！
外泌体miRNA测序案例
Li L, Li C, Wang S, et al. Exosomes Derived from Hypoxic Oral Squamous Cell Carcinoma Cells Deliver miR-21 to Normoxic Cells to Elicit a Prometastatic Phenotype. Cancer Res. 2016;76(7):1770-80
电镜检测外泌体形态
制样： • 40ml 培液超速离心分离得到的外泌体，重悬于20-30ul PBS中。 • 吸取样品10ul 滴加于铜网上沉淀1min，滤纸吸去浮液。 • 吸取2%的醋酸双氧铀10ul滴加于铜网上沉淀1min，滤纸吸去浮液。 • 常温干燥十五分钟。上机。 80kv-120kv 成像
Tip：如果使用聚合物沉淀分离的样品打电镜。在电镜 实验前可以使用100KD的超滤管反复洗涤样品数次。去 除杂蛋白后再进行电镜检测，会得到意想不到的效果哦。
外泌体提取方法
外泌体提取方法外泌体是一种细胞外囊泡，其在细胞间传递信号、调节免疫应答、参与细胞间通讯等方面发挥着重要作用。
因此，外泌体的提取方法对于研究细胞间通讯、疾病诊断和治疗等具有重要意义。
本文将介绍几种常用的外泌体提取方法，希望能够对相关研究工作提供一定的参考价值。
1. 超速离心法。
超速离心法是目前常用的外泌体提取方法之一。
首先，将细胞培养上清液收集起来，并经过一系列离心步骤，逐渐提取出外泌体。
这种方法操作简单，提取效率较高，适用于大量样本的处理。
但是，超速离心法需要专业的离心设备，并且在操作过程中需要严格控制离心参数，以确保外泌体的完整性和纯度。
2. 超滤法。
超滤法是利用超滤膜的选择性透过性，将外泌体从细胞培养上清液中分离出来的方法。
这种方法操作简便，无需离心设备，适用于小样本的处理。
但是，超滤法对超滤膜的选择和使用要求较高，需要根据外泌体的大小和特性选择合适的超滤膜，以确保提取的外泌体具有较高的纯度和完整性。
3. 免疫磁珠法。
免疫磁珠法是利用特定抗体与外泌体表面标记物的结合，通过磁珠的作用将外泌体从细胞培养上清液中提取出来的方法。
这种方法操作简便，提取效率高，适用于特定标记物的外泌体的提取。
但是，免疫磁珠法需要具有高特异性和亲和性的抗体，且对于不同类型的外泌体需要选择不同的抗体，因此在实际操作中需要进行充分的前期筛选和验证工作。
4. 超声法。
超声法是利用超声波对细胞培养上清液进行处理，破碎细胞膜，将外泌体释放出来的方法。
这种方法操作简便，无需昂贵的设备，适用于小样本的处理。
但是，超声法对超声处理的参数和时间需要进行严格控制，以避免外泌体的损伤和降解。
综上所述，外泌体提取方法各有特点，选择合适的方法需要根据具体实验要求和条件来确定。
在实际操作中，需要根据样本的特性和实验的目的，选择合适的外泌体提取方法，并进行充分的验证和优化工作，以确保提取的外泌体具有较高的纯度和完整性。
希望本文介绍的外泌体提取方法能够对相关研究工作提供一定的帮助和参考价值。
大鼠血清的4种处理方法对2-DE效果的影响
大鼠血清的4种处理方法对2-DE效果的影响张彬;谭岩【摘要】目的比较大鼠血清样本的4种制备方法对血清蛋白质双向凝胶电泳(2-DE)分离效果的影响.方法分别用直接溶解法、试剂盒沉淀除杂质、改良的TCA/丙酮法和采用去白蛋白及免疫球蛋白试剂盒预处理大鼠血清样本,双向电泳分离血清蛋白；硝酸银染色；imagemaster5.0软件分析所得蛋白质斑点.结果对直接溶解法、试剂盒沉淀除杂质、改良的TCA/丙酮法和采用去白蛋白及免疫球蛋白试剂盒预处理的大鼠血清样本进行双向电泳分离,经3次重复性检测,凝胶的平均蛋白质点数分别为610±54,683±46,735±42和865±39,平均匹配点数为532±39,543±51,623±42和746±52,匹配率为83.4%,86.2%,82.3%和85.5%,分析不同凝胶间蛋白质点在IEF方向的位置偏差为(0.87±0.31)mm,(0.79±0.23)mm,(0.82±0.33)mm和(0.85±0.30)mm,在SDS-PAGE方向上的偏差为(0.84±0.42)mm,(0.81±0.39)mm,(0.99±0.16)mm和(0.97±0.12)mm.结论采用改良的TCA/丙酮沉淀法及采用去白蛋白及免疫球蛋白试剂盒处理的大鼠血清样本进行双向凝胶电泳均能得到分辨率较高且重复性好的电泳图谱,且应用去白蛋白及免疫球蛋白试剂盒优于改良的TCA/丙酮沉淀法.【期刊名称】《中国实验诊断学》【年(卷),期】2012(000)009【总页数】4页(P1544-1547)【关键词】血清;蛋白质组学;双向凝胶电泳;高丰度蛋白【作者】张彬;谭岩【作者单位】吉林大学第一临床学院,吉林长春130021; 内蒙古民族大学附属医院,通辽028007;吉林大学第一临床学院,吉林长春130021; 吉林省人民医院医学诊治实验中心,吉林长春130021【正文语种】中文【中图分类】R446.1血液中蕴藏着与疾病发生机制、早期诊断及预后评估密切相关的巨大信息，已成为临床上最为常见且最为重要的诊断标本。
外泌体的提取、鉴定和保存方法研究进展
外泌体的提取、鉴定和保存方法研究进展蒲双双【摘要】外泌体是一种直径介于40～100 nm之间的膜性囊泡,由活体细胞分泌产生,广泛存在于人体各种体液中,富含多种蛋白质和RNA,是细胞间传递生物信息的重要载体,在生理调节和病理发展中都发挥重要作用,是近年来研究的热点.为更深入研究外泌体生物学作用机制,提取高质量的外泌体是首要步骤,基于此,笔者就外泌体的各种提取方法及其优缺点以及鉴定和保存方法的研究进展作如下综述,希望此文能为研究者们提供一些参考,为后续研究打好基础.【期刊名称】《现代检验医学杂志》【年(卷),期】2018(033)005【总页数】4页(P157-160)【关键词】外泌体;提取;鉴定;保存【作者】蒲双双【作者单位】山东中医药大学附属医院检验科,济南 250011【正文语种】中文【中图分类】R446外泌体，于1987年由Johnstone等[1]在研究绵羊网织红细胞时发现，是一种直径介于40～100nm的囊泡样结构。
在电子显微镜下，外泌体由双层磷脂膜包裹，内含丰富的蛋白质以及micro RNA等成分，其中一些独特的蛋白(如CD9，CD63，CD81，HSP70，TSG101等)还可作为外泌体的特征蛋白，在外泌体提取和鉴定中起重要作用。
起初，外泌体被认为是细胞排泄的废物，但近年来，越来越多的研究表明外泌体参与物质运输，还携带和传递重要的生物信息[2]，在介导免疫抗原递呈、树突状细胞的活化、神经退行性疾病发生、肿瘤细胞抗原的转移及肿瘤诊断治疗中发挥重要作用[3～5]。
随着蛋白质组学和基因组学等分析手段的发展，外泌体介导的生物学效应及其背后的分子机制将会更加清晰，但在此研究过程中，外泌体的提取纯化、鉴定及合理保存是首要的步骤，也是一切后续实验的基础，毕竟只有高纯度、高活性的外泌体才能确保后续实验的质量和可信度。
为此我们对目前常用的外泌体提取、鉴定和保存的方法及其优缺点做如下综述：1 外泌体提取方法1.1 超速离心法(差速离心法) 超速离心法是目前制备外泌体的经典方法，是根据外泌体的沉降系数差速离心将其分离出来。
外泌体提取方法
外泌体提取方法
外泌体是由细胞向体外释放的非编码RNA分子，它具有重要的生物学功能，近年来在肿瘤发生及其他重大疾病相关的研究中发挥着重要作用。
为了有效地提取外泌体，说明采用哪种提取方法及影响因素将对未来的研究有重要的意义。
提取外泌体的方法包括离心法、筛选法、化学处理法、生物技术法等。
其中，离心法是一种主要用于质量分析和纯化的技术，可将外泌体从其来源悬液中分离出来；筛选法则是使用离心法、筛选系统和膜材来分离和纯化外泌体；化学处理法则是使用特定的化学处理剂来抑制外泌体的反应；生物技术法也可以用来提取外泌体，尤其是利用病毒技术等。
尽管这几种方法都能有效提取外泌体，然而，不同的方法存在着一些不同的影响因素，例如外泌体的种类、外泌体的分布和悬液的浓度等。
首先，不同种类的外泌体有不同的体积、密度、表面电荷以及其它特征，这些特征会影响外泌体的提取效果；其次，外泌体的分布也会影响提取效果，如果外泌体的分布不均匀，可能会导致离心分离效果差；最后，悬液的浓度也会影响提取效果，如果外泌体的浓度过高，离心分离可能会受到阻碍。
此外，提取外泌体还受到装置类型、操作条件和设备性能等影响。
装置类型包括离心机、飞行时间质谱仪、活性炭吸附仪等；操作条件包括比重，旋转速度，温度和时间等；而设备性能则是指装置的容积、转子最大功率以及其它操作条件。
因此，在提取外泌体时，应综合考虑以上所述影响因素，综合运用不同的提取方法，可以更有效地提取外泌体，及时获得准确的结果。
随着人们对外泌体在肿瘤发生及其他重大疾病发病机制中的作用的
越来越深入的理解，提取外泌体的研究将具有越来越重要的意义。
外泌体提取和鉴定
外泌体提取和鉴定外泌体是一种由细胞分泌的微小囊泡，直径通常在 30 150 纳米之间。
它们在细胞间通讯、疾病诊断和治疗等方面具有重要的作用。
因此，外泌体的提取和鉴定成为了生物医学研究中的关键技术。
外泌体的提取方法多种多样，常见的包括超速离心法、超滤法、免疫亲和捕获法、沉淀法等。
超速离心法是外泌体提取的经典方法。
其基本原理是利用不同的离心速度和时间，逐步去除细胞碎片、大囊泡和其他杂质，最终获得较为纯净的外泌体。
这个过程通常需要多次离心，操作较为繁琐，且需要昂贵的超速离心机设备。
但它的优点是能够获得较高纯度的外泌体。
超滤法是基于膜孔径的大小来分离外泌体。
通过选择合适孔径的超滤膜，可以让小分子物质和溶剂通过，而将外泌体截留在膜上。
这种方法相对简单快捷，但外泌体的纯度可能不如超速离心法。
免疫亲和捕获法是利用抗体与外泌体表面特异性抗原的结合来实现分离。
这种方法具有较高的特异性和选择性，但抗体的成本较高，且可能存在非特异性结合的问题。
沉淀法是通过加入特定的试剂，如聚乙二醇（PEG），使外泌体从溶液中沉淀下来。
该方法操作简便，但获得的外泌体可能会含有较多的杂质。
在实际应用中，选择哪种提取方法取决于实验的需求和条件。
如果需要高纯度的外泌体进行深入的机制研究，超速离心法可能是较好的选择；如果是大规模的样本处理或者对纯度要求不是特别高，沉淀法或超滤法可能更为合适。
提取到外泌体之后，接下来就是鉴定。
外泌体的鉴定通常包括形态学观察、粒径分析、标志物检测等方面。
形态学观察可以通过电子显微镜技术，如透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）。
TEM 能够清晰地显示外泌体的形态、大小和结构；SEM 则可以提供外泌体的表面特征。
通过电镜观察，可以看到外泌体呈现为具有典型双层膜结构的圆形或椭圆形小囊泡。
粒径分析常用的技术是纳米颗粒跟踪分析（NTA）和动态光散射（DLS）。
NTA 可以通过追踪单个颗粒的布朗运动来测量外泌体的粒径分布和浓度；DLS 则是基于散射光强度的波动来计算粒径。
外泌体提取方法总结
外泌体提取方法总结外泌体（extracellular vesicles，EVs）是一种存在于细胞外环境中的脂质包裹的小泡，具有重要的生物学功能，参与了细胞间的信息传递、信号调节以及疾病发生发展等过程。
因此，外泌体的提取方法对于研究其功能和应用具有重要意义。
本文将总结目前常用的外泌体提取方法，并探讨其优缺点及适用范围。
1.超速离心法优点：简便快捷，适用于大样本体积。
缺点：提取物质多样性，包含有细胞碎片和蛋白质、RNA等其他成分，纯度较低。
适用范围：适用于初步提取外泌体，如外泌体的形态学研究等。
2.渗透梯度离心法渗透梯度离心法是在超速离心的基础上进一步提高外泌体纯度的方法。
该方法利用碘化金为基础的木糖密度梯度离心，根据外泌体与碘化金的密度差异，将外泌体进一步分离纯化。
优点：能够获得相对纯净的外泌体制备物。
缺点：操作复杂、耗时，不适用于大样本体积。
适用范围：适用于实验室规模的外泌体研究，如RNA测序、质谱分析等。
3.尺寸筛选法尺寸筛选法是通过纳滤膜或超滤膜的孔径来筛选外泌体。
通常使用孔径为0.1-0.22μm的滤膜将细胞碎片和大颗粒物质滤除，获得富含外泌体的滤液。
优点：操作简单方便、适用于大样本体积。
缺点：滤膜的孔径选择对于获得纯净的外泌体制备物有一定的影响。
适用范围：适用于外泌体的初步筛选和快速提取，如外泌体的蛋白质组学研究等。
4.免疫磁珠法免疫磁珠法是利用磁珠表面特异性抗体与外泌体上特定标志物结合，然后通过磁场将目标物质与杂质分离。
该方法可以选择性地提取特定表面标记的外泌体亚群。
优点：高选择性、高灵敏度，适用于特定外泌体的纯化。
缺点：操作相对复杂，适用于实验室规模的外泌体研究。
适用范围：适用于特定外泌体亚群的纯化和研究，如肿瘤相关外泌体的分离等。
总结起来，外泌体的提取方法各有优缺点，在选择时需要根据实验目的和样本特点进行综合考虑。
超速离心法和渗透梯度离心法适合初步提取外泌体，尺寸筛选法适合快速提取外泌体，免疫磁珠法适合提取特定亚群的外泌体。
19579614_外泌体的不同染色方法效果比较
㊃论 著㊃[收稿日期]2019-03-06;[修回日期]2019-03-14[基金项目]河北医科大学科研发展基金项目(K Y F Z 045)[作者简介]朱艳(1983-),女,河北定州人,河北医科大学实验师,医学硕士,从事透射电镜样品制备及观察研究㊂*通信作者㊂E -m a i l :1335514194@q q.c o m 外泌体的不同染色方法效果比较朱 艳1,张 雷2,周晨明1,闫 静1,孟 丽1*(1.河北医科大学电镜实验中心,河北石家庄050017;2.河北医科大学基础医学院组织胚胎学教研室,河北石家庄050017) [摘要] 目的通过用四氧化锇㊁磷钨酸㊁钼酸铵和醋酸双氧铀4种染液分别对外泌体负染色,并对染色效果进行观察和对比分析,以期选出对外泌体染色效果最好的负染液㊂方法用差速离心法提取外泌体后,采用漂浮法分别用四氧化锇㊁磷钨酸㊁钼酸铵㊁醋酸双氧铀4种不同染液对外泌体进行负染色,透射电镜观察,从外泌体的杯托状或圆盘状结构清晰度㊁膜边缘锐利与否㊁染色背景干净程度㊁反差效果等方面对比4种染液的效果㊂结果四氧化锇的染色背景出现大量泡状结构,外泌体结构不明显㊂磷钨酸对外泌体的染色效果不如醋酸双氧铀和钼酸铵,外泌体的胞膜边缘不清晰,染色背景有杂质㊂钼酸铵对外泌体的染色效果也较好,其囊泡的膜结构较清楚,外泌体的杯托状结构可较清楚见到,但是反差较弱㊂醋酸双氧铀染色下,外泌体典型的杯托状或圆盘状结构清晰可见,膜边缘锐利,染色背景干净,反差效果佳㊂结论醋酸双氧铀对外泌体的染色效果最好,是最合适的负染染液㊂ [关键词] 外泌体;负染色;透射电镜 d o i :10.3969/j.i s s n .1007-3205.2019.09.019 [中图分类号] R 331 [文献标志码] A [文章编号] 1007-3205(2019)09-1068-04C o m p a r i s o no f d i f f e r e n t s t a i n i n g me t h o d sf o r e x o s o m e s Z HU Y a n 1,Z H A N GL e i 2,Z HO U C h e n -m i ng 1,Y A NJ i n g 1,M EN GL i 1*(1.E l e c t r o n M i c r o s c o p y C e n t e r ,H e b e iM e d i c a lU n i v e r s i t y ,S h i j i a z h u a n g 050017,C h i n a ;2.D e p a r t m e n t o fH i s t o l o g y a n dE m b r y o l o g y ,t h eS c h o o l o f B a s i cM e d i c i n eS c i e n c e s ,H e b e iM e d i c a lU n i v e r s i t y ,S h i j i a z h u a n g 050017,C h i n a )[A b s t r a c t ]O b je c t i v e T o c o m p a r e a n d a n a l y z e t h e s t a i n i n g ef f e c t a n d s e l e c t t h e b e s t n eg a t i v e d y e i n g s o l u t i o n f o r e x o s o m e s a f t e r n e g a t i v e l y s t a i n i n g th e e x o s o m e swi t h f o u r k i n d s o f d ye s ,s u c h a s o s m i u mt e t r o x i d e ,p h o s p h o t u n g s t i c a c i d ,a mm o n i u m m o l y b d a t e a n du r a n yl a c e t a t e .M e t h o d s A f t e re x o s o m e s w e r ee x t r a c t e d b y d i f f e r e n t i a lc e n t r i f u g a t i o n ,t h ee x o s o m e s w e r e n e g a t i v e l ys t a i n e d w i t h f o u r d i f f e r e n t d y e i n g s o l u t i o n s o f o s m i u m t e t r o x i d e ,p h o s p h o t u n g s t i c a c i d ,a mm o n i u m m o l y b d a t e a n d u r a n y la c e t a t e b y m e a n s o ff l o a t i n g m e t h o d ,a n d o b s e r v e d b yt r a n s m i s s i o ne l e c t r o n m i c r o s c o p y .T h ec l a r i t y o f t h ec u p -s h a p e do rd i s c -s h a pe ds t r u c t u r eof t h e e x o s o m e s ,t h es h a r p n e s so f t h ef i l m e dg e ,th ec l e a n n e s so f t h es t ai n i n g b a c k g r o u n d ,a n dt h e c o n t r a s t e f f e c tw e r e c o m p a r e d a c c o r d i n g t h e e f f e c t s o f t h e f o u r d y e i n g so l u t i o n s .R e s u l t s O s m i u m t e t r o x i d e s t a i n i n g b a c k g r o u n da p p e a r e dal a r g en u m b e ro fv e s i c l e s ,e x o s o m es t r u c t u r e w a sn o t o b v i o u s .T h ed y e i n g e f f e c to f p h o s p h o t u n gs t i ca c i do ne x o s o m e s w a sn o ta s g o o da st h a to f u r a n i u md i o x i d e a c e t a t e a n d a mm o n i u m m o l y b d a t e .T h e c e l lm e m b r a n e e d ge of e x o s o m e sw a s n o t c l e a r a n dt h ed y e i ng b a c k g r o u n d w a si m p u r i t i e s .A mm o n i u m m o l y b d a t eh a dab e t t e rs t ai n i n ge f f e c t o ne x o s o m e s .T h e m e m b r a n es t r u c t u r eo f t h ev e s i c l e sw a sc l e a r ,a n dt h ec u p -s u p p o r t i n g s t r u c t u r e o f t h e e x o s o m e s c a nb e c l e a r l y se e n ,b u t t h e c o n t r a s tw a sw e a k .U n d e r u r a n i u ma c e t a t e ㊃8601㊃第40卷第9期2019年9月河北医科大学学报J O U R N A L O F H E B E I M E D I C A L U N I V E R S I T YV o l .40 N o .9S e pt . 2019 Copyright ©博看网. All Rights Reserved.h y d r o g e n p e r o x i d e s t a i n i n g,t h e t y p i c a l c u p-s h a p e do rd i s c o i ds t r u c t u r eo f e x o s o m ew e r ec l e a r l y v i s i b l e,t h ee d g eo fm e m b r a n ew a ss h a r p,t h ed y e i n g b a c k g r o u n d w a sc l e a n,a n dt h ec o n t r a s t e f f e c tw e r e g o o d.C o n c l u s i o n T h e u r a n y l a c e t a t e h a s t h e b e s t s t a i n i n g e f f e c t o n e x o s o m e s,a n d i t i s t h em o s t s u i t a b l en e g a t i v e d y e i n g s o l u t i o n.[K e y w o r d s]e x o s o m e s;n e g a t i v e s t a i n i n g;t r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p y外泌体是一种由多囊泡体与细胞膜融合后向胞外分泌的㊁直径为30~150n m[1]之间的小囊泡,内含蛋白质㊁脂质㊁m R N A㊁m i R N A㊁D N A片段等分子[2-3]㊂应激条件下,细胞会发生内吞作用,细胞膜内陷并且出芽形成囊泡,即早期胞内体㊂早期胞内体逐步发育成为晚期胞内体,在发育的过程中,胞内体的胞膜重新发生凹陷出芽,同时将细胞质基质中相应的蛋白质与核酸选择性地包裹于其中,形成许多内囊泡,这一系列囊泡的胞内体统一构成多囊泡胞内体㊂多囊泡胞内体与质膜发生融合,里面的内囊泡被排出细胞外,形成了外泌体㊂通常情况下,外泌体通过3种形式与靶细胞作用:①相邻的细胞将外泌体捕捉;②被距离较远的细胞摄入;③进入循环系统被其他组织吸收[4]㊂很多细胞在正常或者病理情况下均可以分泌外泌体,外周血㊁唾液㊁尿液㊁细胞上清液㊁胸腔积液等体液中均可检测到[5]㊂外泌体在降低心肌损伤㊁促进心血管再生㊁促进神经再生㊁调节免疫应答等方面有重要作用,其可作为肿瘤诊断的早期检查标志物[6]㊂此外,外泌体的内源性和其高效的膜融合特性使其可作为药物载体,应用于疾病的治疗㊂过去关于外泌体靶向药物的研究主要集中在将天然生成的外泌体作为药物载体,但近几年越来越多的研究发现,对外泌体进行特定的修饰,能够显著增强其药物载体的靶向性,从而提高用外泌体治疗的有效性[7-8]㊂分离和提取外泌体并对其鉴定,对于后续的功能研究具有重要意义㊂负染色后透射电镜观察是最常的鉴定方法,负染色所用的样品形态为悬浮液,悬浮液中的外泌体必须达到一定的浓度和纯度,这样才能与染液产生特异的㊁背景清晰的结合反应㊂目前外泌体提取方法有差速离心法㊁免疫亲和法㊁隔离筛选法㊁聚合物沉淀法等,本实验采取的是使用较多的差速离心法,这样提取的外泌体浓度和纯度符合负染色的要求,可观察到外泌体的圆盘状或杯托状结构㊂用作负染色的染液应具有以下特征:有较强的电子散射能力,这样才能产生足够的图像反差;在电子束的轰击下不会熔解升华;溶解度大,否则析出沉淀会污染染色背景;分子小;与样品之间无化学反应等㊂负染色的染液一般由重金属盐配制,目前最常用的负染液是磷钨酸㊁磷钨酸钾和磷钨酸钠;此外,醋酸双氧铀㊁四氧化锇㊁钼酸铵等也常用作负染色液㊂本实验将四氧化锇㊁磷钨酸㊁钼酸铵和醋酸双氧铀4种不同染液对外泌体的染色效果进行对比,以期选出对外泌体最合适的染液㊂1材料与方法1.1试剂与仪器四氧化锇购于美国P o l y s c i e n c e s 公司,用超纯水配制成1%溶液,避光密封保存,3%磷钨酸和3%钼酸铵染液购于北京索莱宝科技有限公司,醋酸双氧铀购于美国S P I公司,用超纯水配制成1%溶液,避光密封保存㊂上述溶液均4ħ保存㊂碳膜铜网购自北京新兴百瑞技术有限公司,超高速离心机购自B e c k m a n公司,透射电子显微镜购自日立公司㊂1.2外泌体提取采用差速离心法提取外泌体㊂促凝管收集正常小鼠血清样本6m L,然后400g离心10m i n,去除细胞,将上清再3000g离心30 m i n,去除细胞碎片等㊂将上清用P B S稀释,20000 g离心30m i n,去除大的囊泡㊂将上清用0.22μm 滤器过滤后100000g离心90m i n㊂弃上清,管底的外泌体沉淀用10m LP B S重悬后100000g离心90 m i n㊂倒掉上清,外泌体沉淀用200μLP B S重悬, 4ħ保存㊂1.3负染色及透射电镜观察采用漂浮法分别用四氧化锇㊁磷钨酸㊁钼酸铵㊁醋酸双氧铀4种不同染液进行负染色,在染色前将4种染液从4ħ拿出,恢复室温后再进行如下操作:①取外泌体悬浮液20μL,滴于碳膜铜网上,室温静置1m i n,用滤纸从铜网边缘吸去多余样品;②反复多次实验发现,铜网在染色液滴珠上漂浮3次效果最佳,故吸取3滴染液滴在封口膜上,每滴50μL,将铜网在每滴染液滴珠上漂浮,随后用滤纸吸去多余染液,铜网在第3滴染液上漂浮留置1m i n,然后用滤纸吸去残留液;③室温干燥铜网,透射电镜观察㊂2结果2.1四氧化锇负染在透射电镜下可观察到外泌体表面被染液包被,脂质双层膜不清晰,外泌体典型的杯托状或圆盘状结构不能显示出来,膜周围有透㊃9601㊃河北医科大学学报第40卷第9期Copyright©博看网. All Rights Reserved.明泡状物质包围,染色背景中有大小不均一的透明泡状物质(图1)㊂2.2磷钨酸负染在透射电镜下可观察到外泌体表面有部分凹陷,圆盘状结构大致可见,膜的边缘不清晰且呈毛刺状,染色背景中有不明物质,形状不规则,其中圆形不明物质不能与外泌体进行明显区分(图2)㊂2.3钼酸铵负染在透射电镜下可观察到外泌体的囊泡结构,表面凹陷,可见不规则的杯托状结构,膜边缘较清楚,染色背景较清晰,但是反差较弱(图3)㊂2.4醋酸双氧铀负染在透射电镜下可观察到外泌体表面凹陷,呈现典型的杯托状及圆盘状的囊泡结构,胞膜结构清晰可见,膜边界清楚锐利,染色背景干净,反差明显,观察效果最佳(图4)㊂图1四氧化锇负染色外泌体(B a r=200n m)F i g u r e1T h e e x o s o m e s s t a i n e db y o s m i u mt e t r a o x i d e(B a r=200n m)图2磷钨酸负染色外泌体(B a r=200n m)F i g u r e2T h e e x o s o m e s s t a i n e db y p h o s p h o t u n g s t i c a c i d(B a r=200n m)图3钼酸铵负染色外泌体(B a r=200n m)F i g u r e3T h e e x o s o m e s s t a i n e db y a m m o n i u m m o l y b d a t e(B a r=200n m)图4醋酸双氧铀负染色外泌体(B a r=200n m)F i g u r e4T h e e x o s o m e s s t a i n e db y u r a n y l a c e t a t e(B a r=200n m)3讨论外泌体是1983年由J o h n s t o n e等[9]在绵羊网织红细胞中首次发现,其主要来源是细胞内溶酶体内陷形成多囊泡体,多囊泡体与细胞膜融合然后释放到胞外基质㊂外泌体的分泌过程与细胞的种类和生理或病理状态有关,并且受到靶向装载的内容物和内容物装载分子机器的调控㊂其分子机器主要由胞内体运输装载复合体(e n d o s o m a l s o r t i n gc o m p l e x e s r e q u i r e df o r t r a n s p o r t,E S C R T)和相关蛋白(V P S4㊁V T A1㊁A L I X)组成,其中E S C R T由4个不同作用的亚单位参与构成:使内容物聚积的E S C R T-0㊁介导界膜凹陷出芽的E S C R T-Ⅰ/E S C R T-Ⅱ以及诱导囊泡脱落的E S C R T-Ⅲ㊂此外,外泌体还有非E S C R T依赖途径的细胞生成,在缺乏重要的E S C R T成分时,细胞可以通过脂质㊁四跨膜蛋白或热休克蛋白相关的不同方式形成外泌体[10]㊂随着越来越多的研究深入其中,实验发现外泌体是细胞间信息交流的重要载体,通过释放信号分子或者通过膜融合释放信号物质进入靶细胞,从而改变受体细胞基因表达,进而影响靶细胞生物学功能[11]㊂外泌体来源的细胞类型不同,其功能也不同,它们参加很多机体活动的调节,如免疫应答㊁细胞迁移和分化以及肿瘤侵袭等㊂有研究证实来自肿瘤的外泌体可以参与肿瘤细胞和基底细胞之间的遗传信息交流,有可能使血管过度增生,从而促进肿瘤生长和侵袭[12]㊂另外,有研究显示肿瘤细胞来源的外泌体输送到远端细胞后,外泌体能够使遗传内容物得以完整保存,从而在受体细胞中发挥重要的调节作用,通过这种非细胞间接触的方式显著促进小胶质细胞介导的炎症反应[13]㊂除了上述方面的进展外,外泌体在治疗方面的应用研究也有很大的拓展㊂在机体发病过程中细胞释放产生的外泌体,其包含的内容物组分发生一些变化后,可使得外泌体膜表面或者内部携带特定的蛋白质,以用于靶向识别病变细胞,使得利用外泌体对致病细胞进行靶向治疗有了很大的可行性㊂有实验表明,外泌体作为载体在治疗阿尔茨海默病㊁心肌缺血性再灌注损伤等方面能获得较好的治疗效果[14]㊂在对外泌体的研究中,负染色后进行透射电镜观察是研究外泌体形态最常用的实验方法㊂负染色样品不需经过固定㊁脱水㊁包埋和超薄切片等复杂的透射电镜样品制备操作,而是将样品匀浆悬浮液直接进行染色㊂负染色技术优点明显:操作简单快速,染液用量非常少,分辨率较高㊂因此,广泛应用于细菌㊁病毒及一些大分子结构的研究中,是一项很重要的实验技术㊂其原理是利用高密度的㊁在透射电镜下不显示结构的重金属盐(如磷钨酸㊁四氧化锇等),将生物标本包围起来,增强了背景散射电子的水平,吸附了重金属盐的样品的细微结构在黑暗的背景上显示阴性反差㊂负染色方法有滴染法和漂浮法㊂滴染法是用一根毛细吸管吸取一滴样品悬液滴在有膜的铜网上,静置数分钟,用滤纸从铜网边缘吸去多余的液体,然后滴上负染色液,染色1~2m i n用滤纸㊃0701㊃河北医科大学学报第40卷第9期Copyright©博看网. All Rights Reserved.吸去负染色液,干燥后可用于电镜观察㊂漂浮法是将带有样品悬浮液的带膜铜网在负染色液的液滴上漂浮,在漂浮期间染色液被吸附在铜网的支持膜上,经多次染色对比发现,漂浮染色3次效果最佳,具体操作为前2次漂浮染色时间迅速,最后1次漂浮染色停留1m i n,然后干燥观察㊂此外,铜网支持膜的选择也很重要,生物大分子样品或病毒样品最好使用碳膜作支持膜㊂使用其他支持膜,在电镜观察时经常会发生样品漂移,造成拍摄照片困难,故本实验选择的是碳膜铜网㊂本研究对比了四氧化锇㊁磷钨酸㊁钼酸铵和醋酸双氧铀4种负染染液对外泌体的不同染色效果,发现醋酸双氧铀染色效果最佳,钼酸铵次之㊂本实验之所以选择四氧化锇作为染液之一,是因为考虑到外泌体富含胆固醇和鞘磷脂,而四氧化锇能固定脂蛋白,使生物膜结构的主要成分林脂蛋白稳定,同时又有较强的电子散射能力㊂但实验并未出现预期效果,染色背景出现大量泡状结构,外泌体周围也被泡状物质包围,这种现象可能与电子束与四氧化锇染液作用有关,具体机制尚不明确㊂磷钨酸作为常规负染染液,对外泌体的染色效果不如醋酸双氧铀和钼酸铵,外泌体的胞膜边缘不清晰,染色背景中有不明物质,形状不规则,其中圆形不明物质不能与外泌体进行明显区分㊂钼酸铵常用于病毒的负染色,本实验中对外泌体的染色效果也较好,其囊泡的膜结构较清楚,外泌体的杯托状结构可较清楚见到,但是反差较弱㊂醋酸双氧铀染色下,外泌体典型的杯托状或圆盘状结构清晰可见,膜边缘锐利,染色背景干净,反差效果佳,是最合适的负染染液㊂近几年,外泌体在临床应用方面的研究不断获得新的拓展,针对肿瘤㊁糖尿病㊁心脑血管疾病㊁神经退行性病变等重大疾病,以外泌体为基础的研发均取得了较为明显的进步㊂但是外泌体种类繁多,具体的作用机制尚不明确,需对外泌体进行更深入的研究,以便为外泌体在临床的应用提供更广阔的研究思路㊂虽然透射电镜鉴定外泌体简便直接,但仍有一些不足需要改进,如样本脱水过程易使外泌体形态改变[15]㊂使用冷冻电子显微镜直接观察外泌体,可以不通过染色及化学固定,外泌体的生物活性得以最大程度保存,结合断层成像和图像的三维重构技术,可观察到外泌体更复杂的结构[16]㊂[参考文献][1] Z h a n g H G,G r i z z l e W E.E x o s o m e s:an o v e l p a t h w a y o f l o c a la n dd i s t a n ti n t e r c e l u l a rc o mm u n i c a t i o n t h a tf a c i l i t a t e st h eg r o w t h a n dm e t a s t a s i s o f n e o p l a s t i c l e s i o n s[J].A mJ P a t h o l,2014,184(1):28-41.[2] C l a r kD J,F o n d r i e W E,L i a oZ,e ta l.R e d e f i n i n g t h eb r e a s tc a n c e re x o s o m e p r o t e o m eb y t a nde m m a s st a gq u a n t i t a t i v ep r o t e o m i c s a n dm u l t i v a r i a t e c l u s t e r a n a l y s i s[J].A n a lC h e m,2015,87(20):10462-10469.[3]d eT o r e J,H e r s c h l i kL,W a l d n e rC,e ta l.E m e r g i n g r o l e so fe x o s o m e s i nn o r m a l a n d p a t h o l o g i c a l c o n d i t i o n s:n e wi n s i g h t sf o rd i ag n o s i sa n dth e r a p e u ti ca p p l i c a t i o n s[J].F r o n tI m m u n o l,2015,6:203.[4] P u g h o l m L H,R e v e n f e l d A L,S o n d e r g a a r d E K,e t a l.A n t i b o d y b a s e d a s s a y s f o r p h e n o t y p i n g o f e x t r a c e l l u l a r v e s i c l e s[J].B i o m e dR e s I n t,2015,2015:524817.[5] T h e r y C,Z i t v o g e lL,A m i g o r e n aS.E x o s o m e s:c o m p o s i t i o n,b i o-g e n e s i s a n d f u nc t i o n[J].N a tR e v I mm u n o l,2002,2(8):569-579.[6] Y uS,C a oH,S h e nB,e t a l.T u m o r-d e r i v e d e x o s o m e s i n c a n c e rp r o g r e s s i o na n d t r e a t m e n t f a i l u r e[J].O n c o t a r g e t,2015,6(35):37151-37168.[7] D o n g X,G a o X,D a i Y,e t a l.S e r u m e x o s o m e s c a nr e s t o r e c e l l u l a rf u n c t i o ni n v i t r o a n d b e u s e df o rd i a g n o s i si n d y s f e r l i n o p a t h y[J].T h e r a n o s t i c s,2018,8(5):1243-1255.[8]程显达,王浩,李庆伟.外泌体作为疾病诊断标志物及药物载体的应用前景[J].中国生物化学与分子生物学报,2018,34(12):1280-1285.[9]J o h n s t o n e R M,A d a m M,H a mm o n d J R,e t a l.V e s i c l ef o r m a t i o n d u r i ng r e t i c u l o c y t e m a t u r a t i o n.A s o c i a t i o n o fp l a s m a m e m b r a n e a c t i v i t i e s w i t h r e l e a s e d v e s i c l e s(e x o s o m e s)[J].JB i o l C h e m,1987,262(19):9412-9420.[10]甘飞鸿,宫苹,姚洋.外泌体的生物学作用及其在口腔疾病中的研究[J].口腔生物医学,2018,9(4):210-215. 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广东化工 2019年第2期第46卷总第388期-23 -大鼠血清外泌体不同提取方法的比较罗哲斯，钟成勇，秦转，李艳文，毛建文**［收稿日期］2018-11-28［基金项目］广东省高等学校“千百十工程”人才培养项目(2015cxqx214)［作者简介］罗哲斯(1992-),女，广东清远人，硕士研究生，主要研究方向为分子药理学。
*为通讯作者：毛建文，男，湖南人，博士，教授，主要从事离子通道蛋白与疾病及外泌体功能的研究。
(广东药科大学生命科学与生物制药学院，广东广州510006)［摘 要］目的：比较大鼠血清外泌体的不同提取方法，优化PEG 聚沉法。
方法：分别采用差速超速离心法、试剂盒法、PEG 聚沉法及优化后的PEG 聚沉法提取分离血清外泌体。
通过Western Blotting 检测外泌体标记蛋白：透射电镜观察形态。
结果：Western Blotting 检测出外泌体 的标记蛋白：电镜下观察到差速超速离心法和优化后的PEG 聚沉法提取的外泌体粒径在100 nm 左右，呈双层膜结构，试剂盒法和PEG 聚沉法 提取的外泌体形态大小不一，杂质偏多。
结论：优化后的PEG 聚沉法能成功提取血清外泌体，此方法操作简便、耗时短、成本低，是可靠且有 效的外泌体提取方法。
［关键词］血清；外泌体；PEG ；差速超速离心；试剂盒［中图分类号］TQ ［文献标识码］A［文章编号］1007-1865(2019)02-0023-02Comparison and Optimization of Different Methods for the Extraction of RatSerum-derived ExosomesLuo Zhesi, Zhong Chengyong, Qin Zhuan, Li Yanwen, Mao Jianwen *(School of Life Sciences and Biopharmaceuticals, GuangdongPharmaceuticalUniversity, Guangzhou 510006, China)Abstract: Objective: To compare different extraction methods of rat serum-derived exosomes and optimize PEG coagulation to obtain more efficient and practical extraction techniques. Methods: Serum exosomes were extracted and separated by differential ultracentrifugation method, kit method, PEG coagulation method and optimized PEG coagulation method. The exosomal marker proteins were detected by Western blotting; the morphology was observed by transmission electron microscope.Results: The expression of exosome labeled protein HSP70, CD63 and TSG101 in exosomes protein obtained by all four extraction methods could detected by Western blotting. The exosomes extracted by differential ultracentrifugation method and optimized PEG coagulation method show a particle size of about 100 nm and a double-layer membrane structure under transmission electron microscope. The exosomes extracted by the kit method and PEG coagulation method were impurities and not uniform in size. Conclusion: The optimized PEG coagulation method was successfully used to extract and separate rat serum-derived exosomes. Compared with the existing methods, this method has the advantages of easy operation, short time-consuming, low-cost and effective.Keywords: Serum ； exosomes ； PEG ； differential ultracentrifugation ； Exo Quick1前言外泌体是指包含了多种mRNA 、miRNA 和蛋白质的微小囊 泡，直径在30〜150nm 之间，呈茶托形或一侧凹陷的半球形结构。
1987年，Johnstone 将其命名为"exosome"⑴。
其主要来源于细 胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜 融合后释放到胞外基质中［2】。
Tucci M 等人研究发现，转移性黑素 瘤患者的血清中能提取到黑色素瘤细胞分泌的外泌体，并检测岀 所患转移性黑色素瘤是否对化疗药物敏感⑶。
与此类似,Repiska G 等人发现，从孕妇血清中提取的外泌体能检测到胎儿的DNA 【4】。
由此可见，血清外泌体能够参与到病理生理过程中。
目前我们对血清外泌体的研究尚处于初级阶段，要想实现最 终的临床上的指导应用，还有许多亟待解决的难题。
其中，从成 分复杂的血清中获得结构完整，形态大小均一，并保留其生物学 特性的外泌体，是目前的一个重难点⑸。
现阶段外泌体的提取方 法主要有：超速离心法、密度梯度离心法、色谱法、过滤离心和 试剂盒提取法等。
本文就将差速超速离心法、试剂盒法、PEG 聚 沉法和优化后的PEG 聚沉法用于血清外泌体的提取并进行比较， 期望获得简便快捷和性价比高的提取方式。
2实验材料与方法2.1试剂及仪器PEG 6000(E125BA0029)购自生工生物工程股份有限公司； Total Exosome Isolation (00520032)购自 Invitrogen 公司；CD63 抗 体(BA1584)和TSG101抗体(PB0550)购自武汉博士德生物工程有 限公司，HSP70抗体(AH728)购自上海碧云天生物技术有限公司； L-100XP 低温超速离心机购自美国Beckman 公司；透射电镜 (H7650)购自日本Hitachi 公司。
2.2实验方法2.2.1差速超速离心法提取外泌体取1 mL 大鼠血清，加入19 mL PBS, 300 g, 4 °C 离心10 min 。
取上清转移到新的离心管中，2000 g, 4 °C 离心10 mine 取上清 转移至新的离心管，10000 g, 4 °C 离心30 min ；取上清置于超离 管中，100000 g, 4 °C 离心70 min,去上清，加入20 mL PBS 重悬，100000 g, 4 °C 离心70 min,底部沉淀即外泌体。
2.2.2试剂盒法提取外泌体按照Total Exosome Isolation (00520032)试剂盒说明书进行提取。
2.2.3 PEG 聚沉法提取外泌体16 g PEG 6000+5.844 g NaCl+100 mL 超纯水配制成 8%PEG 6000(2X)溶液；10 g PEG 6000+5.844 g NaCl+100 mL 痼纯水配制 成 5%PEG6000(2X)溶液。
取ImL 大鼠血清,2000g,4 °C 离心30 min 。
取上清于1.5 mL 离心管，按1 ： 1的比例，在血清中加入8%PEG6000(2X), 4 °C 静置孵育30 min 后，10000 g, 4 °C 离心1 h 。
去除上清，用PBS 重悬后加入5%PEG6000(2X), 4匸静置孵育30 min 后，10000 g, 4 °C 离心1 h,底部沉淀即外泌体。
2.2.4 PEG 聚沉法经超速离心法优化提取外泌体取1 mL 大鼠血清，2000 g,4 °C 离心30 min 。
取上清于1.5 mL 离心管，按1 ： 1的比例，在血清中加入8%PEG6000(2X), 4 °C 静置孵育30 min 后，10000 g, 4 °C 离心1 h 。
去除上清，用20 mL PBS 重悬，100000 g, 4 °C 离心70 min,底部沉淀即外泌体。
2.2.5提取外泌体总蛋白及免疫印迹裂解上述外泌体并提取其总蛋白，以等样蛋白浓度跑10%丙 烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后转移至PVDF 膜，5%脱脂奶粉封闭 2 h, 4 °C 孵育HSP70、CD63和TSG101 —抗过夜，加入相应二 抗室温孵育lh 后，于蛋白成像系统中进行曝光成像，拍摄图片。
2.2.6形态学分析取上述外泌体于铜网上，负染后在透射电镜下观察其形态。
3结果3.1外泌体标记蛋白HSP70、CD63、TSG101表达的检测差速超速离心法、试剂盒法、PEG 聚沉法、经超速离心法优 化的PEG 聚沉法所提的外泌体中均检测到外泌体标记蛋白 HSP70、CD63和TSG101的表达，四种方法没有明显差别，见图 lo广东化工2019年第2期第46卷总第388期•24•UC Exo Q PEG PEG+UC HSP70CD63TSG101UC：差速超速离心法；ExoQ：试剂盒法；PEG：PEG聚沉法；PEG+UC：经超速离心法优化的PEG聚沉法图1HSP70、CD63、TSG101在不同方法所提的外泌体中的表达Fig.1The expression of HSP70,CD63and TSG101in exosomesisolated from different methods3.2外泌体透射电镜下形态学检测在透射电镜下观察，四种方法所提取的外泌体形态如图2所示。