大鼠血清外泌体不同提取方法的比较

广东化工
2019年第2期第46卷总第388期
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大鼠血清外泌体不同提取方法的比较
罗哲斯，钟成勇，秦转，李艳文，毛建文*
*［收稿日期］2018-11-28
［基金项目］广东省高等学校“千百十工程”人才培养项目(2015cxqx214)
［作者简介］罗哲斯(1992-),女，广东清远人，硕士研究生，主要研究方向为分子药理学。

*为通讯作者：毛建文，男，湖南人，博士，教授，主要从事离子通道蛋白与疾病及外泌体功能的研究。

(广东药科大学生命科学与生物制药学院，广东广州510006)
［摘 要］目的：比较大鼠血清外泌体的不同提取方法，优化PEG 聚沉法。

方法：分别采用差速超速离心法、试剂盒法、PEG 聚沉法及优化
后的PEG 聚沉法提取分离血清外泌体。

通过Western Blotting 检测外泌体标记蛋白：透射电镜观察形态。

结果：Western Blotting 检测出外泌体 的标记蛋白：电镜下观察到差速超速离心法和优化后的PEG 聚沉法提取的外泌体粒径在100 nm 左右，呈双层膜结构，试剂盒法和PEG 聚沉法 提取的外泌体形态大小不一，杂质偏多。

结论：优化后的PEG 聚沉法能成功提取血清外泌体，此方法操作简便、耗时短、成本低，是可靠且有 效的外泌体提取方法。

［关键词］血清；外泌体；PEG ；差速超速离心；试剂盒［中图分类号］TQ ［文献标识码］A
［文章编号］1007-1865(2019)02-0023-02
Comparison and Optimization of Different Methods for the Extraction of Rat
Serum-derived Exosomes
Luo Zhesi, Zhong Chengyong, Qin Zhuan, Li Yanwen, Mao Jianwen *
(School of Life Sciences and Biopharmaceuticals, GuangdongPharmaceuticalUniversity, Guangzhou 510006, China)
Abstract: Objective: To compare different extraction methods of rat serum-derived exosomes and optimize PEG coagulation to obtain more efficient and practical extraction techniques. Methods: Serum exosomes were extracted and separated by differential ultracentrifugation method, kit method, PEG coagulation method and optimized PEG coagulation method. The exosomal marker proteins were detected by Western blotting; the morphology was observed by transmission electron microscope.Results: The expression of exosome labeled protein HSP70, CD63 and TSG101 in exosomes protein obtained by all four extraction methods could detected by Western blotting. The exosomes extracted by differential ultracentrifugation method and optimized PEG coagulation method show a particle size of about 100 nm and a double-layer membrane structure under transmission electron microscope. The exosomes extracted by the kit method and PEG coagulation method were impurities and not uniform in size. Conclusion: The optimized PEG coagulation method was successfully used to extract and separate rat serum-derived exosomes. Compared with the existing methods, this method has the advantages of easy operation, short time-consuming, low-cost and effective.
Keywords: Serum ； exosomes ； PEG ； differential ultracentrifugation ； Exo Quick
1前言
外泌体是指包含了多种mRNA 、miRNA 和蛋白质的微小囊 泡，直径在30〜150nm 之间，呈茶托形或一侧凹陷的半球形结构。

1987年，Johnstone 将其命名为"exosome"⑴。

其主要来源于细 胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜 融合后释放到胞外基质中［2】。

Tucci M 等人研究发现，转移性黑素 瘤患者的血清中能提取到黑色素瘤细胞分泌的外泌体，并检测岀 所患转移性黑色素瘤是否对化疗药物敏感⑶。

与此类似,Repiska G 等人发现，从孕妇血清中提取的外泌体能检测到胎儿的DNA 【4】。

由此可见，血清外泌体能够参与到病理生理过程中。

目前我们对血清外泌体的研究尚处于初级阶段，要想实现最 终的临床上的指导应用，还有许多亟待解决的难题。

其中，从成 分复杂的血清中获得结构完整，形态大小均一，并保留其生物学 特性的外泌体，是目前的一个重难点⑸。

现阶段外泌体的提取方 法主要有：超速离心法、密度梯度离心法、色谱法、过滤离心和 试剂盒提取法等。

本文就将差速超速离心法、试剂盒法、PEG 聚 沉法和优化后的PEG 聚沉法用于血清外泌体的提取并进行比较， 期望获得简便快捷和性价比高的提取方式。

2实验材料与方法
2.1试剂及仪器
PEG 6000(E125BA0029)购自生工生物工程股份有限公司； Total Exosome Isolation (00520032)购自 Invitrogen 公司；CD63 抗 体(BA1584)和TSG101抗体(PB0550)购自武汉博士德生物工程有 限公司，HSP70抗体(AH728)购自上海碧云天生物技术有限公司； L-100XP 低温超速离心机购自美国Beckman 公司；透射电镜 (H7650)购自日本Hitachi 公司。

2.2实验方法
2.2.1差速超速离心法提取外泌体
取1 mL 大鼠血清，加入19 mL PBS, 300 g, 4 °C 离心10 min 。

取上清转移到新的离心管中，2000 g, 4 °C 离心10 mine 取上清 转移至新的离心管，10000 g, 4 °C 离心30 min ；取上清置于超离 管中，100000 g, 4 °C 离心70 min,去上清，加入20 mL PBS 重
悬，100000 g, 4 °C 离心70 min,底部沉淀即外泌体。

2.2.2试剂盒法提取外泌体
按照Total Exosome Isolation (00520032)试剂盒说明书进行提
取。

2.2.3 PEG 聚沉法提取外泌体
16 g PEG 6000+5.844 g NaCl+100 mL 超纯水配制成 8%PEG 6000(2X)溶液；10 g PEG 6000+5.844 g NaCl+100 mL 痼纯水配制 成 5%PEG6000(2X)溶液。

取ImL 大鼠血清,2000g,4 °C 离心30 min 。

取上清于1.5 mL 离心管，按1 ： 1的比例，在血清中加入8%PEG6000(2X), 4 °C 静置孵育30 min 后，10000 g, 4 °C 离心1 h 。

去除上清，用PBS 重悬后加入5%PEG6000(2X), 4匸静置孵育30 min 后，10000 g, 4 °C 离心1 h,底部沉淀即外泌体。

2.2.4 PEG 聚沉法经超速离心法优化提取外泌体
取1 mL 大鼠血清，2000 g,4 °C 离心30 min 。

取上清于1.5 mL 离心管，按1 ： 1的比例，在血清中加入8%PEG6000(2X), 4 °C 静置孵育30 min 后，10000 g, 4 °C 离心1 h 。

去除上清，用20 mL PBS 重悬，100000 g, 4 °C 离心70 min,底部沉淀即外泌体。

2.2.5提取外泌体总蛋白及免疫印迹
裂解上述外泌体并提取其总蛋白，以等样蛋白浓度跑10%丙 烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后转移至PVDF 膜，5%脱脂奶粉封闭 2 h, 4 °C 孵育HSP70、CD63和TSG101 —抗过夜，加入相应二 抗室温孵育lh 后，于蛋白成像系统中进行曝光成像，拍摄图片。

2.2.6形态学分析
取上述外泌体于铜网上，负染后在透射电镜下观察其形态。

3结果
3.1外泌体标记蛋白HSP70、CD63、TSG101表达的检测
差速超速离心法、试剂盒法、PEG 聚沉法、经超速离心法优 化的PEG 聚沉法所提的外泌体中均检测到外泌体标记蛋白 HSP70、CD63和TSG101的表达，四种方法没有明显差别，见图 lo
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UC Exo Q PEG PEG+UC HSP70
CD63
TSG101
UC：差速超速离心法；ExoQ：试剂盒法；PEG：PEG聚沉法；PEG+UC：
经超速离心法优化的PEG聚沉法
图1HSP70、CD63、TSG101在不同方法所提的外泌体中的表
达
Fig.1The expression of HSP70,CD63and TSG101in exosomes
isolated from different methods
3.2外泌体透射电镜下形态学检测
在透射电镜下观察，四种方法所提取的外泌体形态如图2所示。

差速超速离心法所提外泌体呈明显茶托状的双层膜结构，粒径在lOOnm左右(图A)；试剂盒法所提外泌体有较多铁蛋白结晶，粒径大小不一(图B)；PEG聚沉法所提外泌体与试剂盒法相似，且有PEG和蛋白的聚沉物(图C)；经超速离心法优化的PEG聚沉法提取的外泌体，在电镜下可见茶托形结构，粒径在lOOnm左右，纯度较高(图D)o
(A)差速超速离心法；(B)试剂盒法；(C)PEG聚沉法：(D)经超速离心法优
化的PEG聚沉法
图2透射电镜下不同方法所提取的外泌体形态
Fig.2Morphology of exosome extracted by different methods under
transmission electron microscopy
4讨论
Jhonestone等人在研究网织红细胞向成熟红细胞转化时发现了外泌体⑴。

随着研究的深入，人们对外泌体有了更深的认识，发现其广泛存在于体液当中，并通过体循环进入到身体各个部位，参与众多的生理病理过程。

由于体液中内容物丰富，杂质较多，将外泌体从中有效的分离出来是个亟待解决的难题⑸。

主流的外泌体分离方法是差速超速离心法，但其分离耗时较长，前期准备工作繁杂，且得率不高。

免疫磁珠法操作简单，可以保证外泌体的结构完整，但是非中性pH和非生理性盐浓度对外泌体生物活性有影响⑹。

色谱法提取分离的外泌体大小均一，但对设备要求较高，应用不广泛。

从我们的实验结果可看出，差速超速离心法、试剂盒法、PEG 聚沉法与经超速离心法优化的PEG聚沉法都能在蛋白免疫印迹的结果中检测出外泌体标记蛋白HSP70、CD63及TSG101,表明上述方法均能提取到相当数量的外泌体。

差速超速离心法所提的外泌体，形态结构得到很好的保留，可见茶托形的圆形或椭圆形的微小囊泡，粒径落在lOOnm左右，但差速超速离心法耗时长，对设备要求较高。

试剂盒法所提取的外泌体掺杂较多的杂质，大小不一，立体结构不明显。

PEG是很好的增溶剂，广泛应用于液体制剂，在沉淀及纯化病毒颗粒方面有很高应用⑺。

PEG聚沉法提取的外泌体，杂质较多，粒径与试剂盒法的相似，且形态结构也受到了一定的破坏。

而经超速离心法优化的PEG聚沉法得到的外泌体呈一侧凹陷的半球形结构，纯度较PEG聚沉法高，粒径落在lOOnm左右。

本研究通过对比上述四种方法提取的外泌体，发现经超速离心法优化的PEG聚沉法耗时较短，操作简便，得率高且纯度高，可以在一般的实验室广泛应用，这对外泌体的进一步研究提供了更大的便利。

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