普通微生物学实验02--细菌革兰氏染色与霉菌形态观察

霉菌形态观察
曲霉
根霉
青霉
曲霉
显微镜操作
奥林巴斯生物显微镜
目镜 物镜 载物台 聚光镜 细准焦螺旋 粗准焦螺旋 照明器
取镜 对光 低倍镜观察：
把所要观察的玻片标本放在载物台上，用压片夹压住，
标本要正对通光孔。转动粗准焦螺旋，顺时针旋转，使 载物台上升，直到物镜接近玻片标本（~0.5 cm）为止【 注意：此时眼睛一定要看着物镜！】。观看目镜，用粗 准焦螺旋逆时针方向降低载物台至视野内出现物象后， 改用细准焦螺旋调至视野出现清晰物象，并将最好部位 推至视野正中央，准备换高倍镜观察。
7、载物台要保持清洁干燥。如使用新鲜材料做临时装片，必须在载玻片上 加盖盖玻片。切勿让材料、水滴、试剂接触物镜和载物台。如沾上，应立 即揩擦干净，以免镜头等被污染和腐蚀。
8、在高倍镜下调节焦距时，切勿使用粗调节器，以免压坏标本，损坏物镜。
9、高倍镜使用完毕，必须先上升镜筒，移开镜头后再取出玻片标本，以免 取玻片时擦损镜头的镜面。
高倍镜观察：
将高倍镜（40X）转至镜筒下方，操作时要从侧面注视，
防止镜头与玻片相撞。调节光圈和聚光镜使光线亮度适 中。观察时先用粗准焦螺旋慢慢下降载物台至发现物象 ，再用微准焦螺旋调至物象清晰为止。仔细观察后，移 动最好部位至视野中央，准备换油镜做进一步观察。
油镜观察： 细菌或其他标本的细微结构都需要用油镜（90X
1884年，丹麦医生革兰(C. Gram) 发明 的一种鉴别不同类型细菌的染色方 法。 把几乎所有的细菌分为：
革兰氏阳性菌（G＋） 革兰氏阴性菌（G－）。
结果: 革兰氏阳性菌——紫色 革兰氏阴性菌——红色
G+和G-细胞壁结构比较
革兰氏染色原理
通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶
于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较 厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙 酮脱色处 理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇 处理不会出现缝隙，，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在 壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性 菌因其细胞壁薄、外膜 层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以 类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结 晶紫与碘复合物的溶 出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再 经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。
带正电荷的染料离子可使细菌细胞染成蓝色。常用的碱性染料除美 蓝外，还有结晶紫（crystal violet）、碱性复红（basicfu-chsin）、番红（ 又称沙黄，safranine）等。
细菌体积小，较透明，如未经染色常不易识别，而经着色后，与背 景形成鲜明的对比，使易于在显微镜下进行观察。
革兰氏染色
或100X）观察。
显微镜操作注意事项
1、必须遵守操作规程，严格认真地按要求操作。取送显微镜时，应右 手握住镜臂， 左手托住镜座，轻拿轻放。切勿用 一只手斜提，前后摆 动，防止目镜滑出跌落。
2、保护好镜头，揩试目镜、物镜上的灰尘或污物，必须使用专用的擦 镜纸。切勿用手指、手帕、纱布和普通纸擦。
3、物镜镜头的切换一定要使用转换器，以免使镜头脱落和损坏。
革兰氏染色基本步骤
基本步骤：
涂片固定—— 结晶紫初染—— 碘液媒染——95%乙醇脱 色0.5min—— 番红复染1min
结果: 革兰氏阳性菌——紫色 革兰氏阴性菌——红色
革兰氏染色步骤
结晶紫初染（1~2 min） 水洗 碘液媒染（~1 min） 水洗 95%乙醇脱色（20~30 s至流出酒精刚刚不出现颜色） 立即水洗 番红复染（2~3 min） 水洗 干燥
4、转动粗、细准焦螺旋时，不要用力过猛，以防止机件损伤，调节失 灵。
5、镜检时，坐姿端正，一般用左眼观察物象，用右眼看着实验报告纸 画图。两眼须同时睁开，以减少疲劳。
显微镜操作注意事项
6、切忌一面从目镜进行观察，一面使镜筒下降，这样容易使物镜与玻片标 本碰撞而损坏；也不能持续转动粗调节器，使镜筒一直上升，这样会使镜 筒内的齿板和齿轮脱钩，以致镜筒跌出。
注意事项
不要取过多的菌体，细菌数量巨大，取少许足够
实验观察，并且效果更好。
严格按照说明进行染色，尤其是乙醇脱色步骤，
20~30 s后立即用清水冲洗。
不要用水直接冲洗菌膜。 不要用滤纸直接接触菌膜吸水。 滴加的任何溶液最好不要直接接触，而是应该悬
空滴加，或者用一次性枪头加。
霉菌形态观察
革兰氏染色
10 ×100
10 ×100
E. coli G-
B. subtilis G+
明显大肠杆菌小，枯草芽孢杆菌大。大肠杆菌染色后呈
现红色，而枯草芽孢杆菌呈现蓝紫色。
10 ×10
青霉
10 ×40 10 ×4 ×40
实验原理： 制片时，常用乳酸石碳酸棉兰染液，做成水浸片
进行观察，该染色液是霉菌制片中常用的固定液 ，可以使菌丝分散，细胞不易变形，并具染色、 杀菌作用。
乳酸石碳酸棉兰染色液： 石碳酸20g，乳酸20 mL，甘油40 mL，棉蓝0.05 g
，蒸馏水20 mL。将棉蓝溶于蒸馏水中，再加入 其它成分，微加热使其溶解，冷却后用。
10、绝对禁止随意取出目镜或拆下显微镜的其他部件，以免灰尘掉入镜筒、 部件失落或损坏。
实验步骤
实验材料：
每组1支大肠杆菌，1支枯草芽孢杆菌 全班1平板青霉，1平板曲霉，1平板根霉
实验内容：
1、每个人都需要做革兰氏染色，需要做一个阳性细菌，一个阴性细 菌。
2、每个人都要做一个霉菌水浸片，但是不需要每个都做，每组安排 好，三种霉菌都要有人做，保证每个人最后三种霉菌都观察过就行。
革兰氏染色的意义
对于实验的指导
革兰氏阳性细菌不容易进行基因操作，难以用 转化的方法导入外源DNA。进行基因组提取的时候 需要用溶菌酶进行细胞壁裂解。
临床意义
其重要的临床意义在于：1.鉴别细菌 2.选择药 物 3.与致病性有关：：革兰氏阳性菌能产生外毒素 ，革兰氏阴性菌能产生内毒素，两者的致病作用不 同。
实验二 微生物的染色与形态观察
细菌染色原理
在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，所以常
用碱性染料进行染色。碱性染料并不是碱，和其他染料一样是一种盐， 电离时染料离子带正电，易与 带负电荷的细菌结合而使细菌着色。例如 ，美蓝（亚甲蓝）实际上是氯化亚甲蓝盐（methylenebluechloride，缩写 为MBC），它可被电离 成正、负离子： MBC→methylene blue++chloride-