动物细胞工程实验

实验一机械法分离培养动物细胞及计数

一.实验目的

1.掌握机械法分离培养动物细胞的原理及方法

2.掌握细胞计数的方法

二.实验原理

在机体中，器官通常由几种组织构成，组织又由细胞通过紧密连接锚定连接、通讯连接构成组织。采用机械法破坏细胞间的连接，能获得单个细胞。本实验采用剪碎小白鼠肝组织的方法获取单个肝细胞，该方法简单易行。

三.实验材料

1.动物：小白鼠（成年）

2.试剂：PBS缓冲液，RPMI-1640培养液

3.器材：手术器械、试管、滤网、离心管、离心机、显微镜等；

四.实验方法

1.无菌获取肝组织

取成年小白鼠一只，断颈处死，腹部向上置于解剖盘中，碘酒消毒1-2次，75%酒精洗碘。剪开腹壁，暴露肝脏组织，换手术器材，剪取0.3mm3肝脏组织块，置于培养皿中。

2.获取细胞

剔除脂肪组织，加PBS缓冲液1ml，反复冲洗2-3次，剪碎组织块至1mm3，加RPMI-1640培养液，滤网过滤至离心管。平衡、离心（1000rpm,5min），弃上清，加培养液1ml，吹打均匀，成细胞悬液。

3.细胞计数

取细胞计数板一个，盖上盖玻片，去细胞悬液，沿盖玻片便于滴1滴，显微镜下计细胞数，原则：计上不计下，计左不计右

4.细胞培养

加细胞培养液，稀释至1X105个/ml，移入培养皿，37℃，CO25%培养箱中培养

四.实验结果

实验二酶消化法分离培养小鼠胎儿成纤维细胞

一.实验目的

掌握消化分离培养小鼠胎儿成纤维细胞的基本方法

二.实验原理

胰蛋白酶是一种消化酶，它通过作用于精氨酸或赖氨酸之剑的肽键，能破坏细胞间的连接，进而从组织块中分离获得单个细胞；细胞之间是通过CAM相连，而很多粘性分子只有在+2价金属离子，如Ca2+,Mg2+的存在下，才能行使这种功能，在胰蛋白酶中加EDTA的作用是熬合这些二价例子，使细胞被消成单细胞状态；本实验就是采用胰蛋白酶和EDTA消化小鼠胎儿肌肉细胞获得单个细胞。

三.实验器材

1.试剂：10%犊牛血清（NBS）的1640培养液，0.25%胰蛋白酶，0.04%EDTA，PBS

2.器械：离心机，滴管，普通天平，手术器械，血球计数板，离心管等

3.材料：怀孕13-17天母鼠

四.实验步骤

1.取材：断颈处死怀孕小鼠，腹部向上置于解剖盘中，碘酒消毒1-2次，75%酒精脱碘，剪开腹壁，更换手术器械，取胎儿置培养皿中

2.剔除和清洗：从子宫中挤出胎儿，剪去胎儿头、尾、四肢、内脏和脊柱后，反复用PBS

冲洗3-4次

3.剪碎：将冲洗干净后的胎儿组织块置另一培养皿中，剪碎至1mm3（剪15-20min）

4.消化：加入4ml0.25%胰蛋白酶消化液，37℃消化5-7min

5.终止：加入4ml含10%NBS的1640培养液终止消化

6.收集细胞：离心用100目滤纱将细胞悬液过滤至离心管中，平衡离心（1000rpm,5min）

7.制备细胞悬液：弃上清，加1ml1640培养液，吹打成细胞悬液

8.细胞形态观察：取载玻片一张，滴细胞悬液一滴，盖上盖玻片，显微镜下观察

9.细胞计数：按上一实验介绍方法计数

10.培养细胞：将稀释至1X105个/ml细胞悬液加入培养皿中，置于5%CO2，37℃，75%湿度培养箱中培养

实验三牛镜子细胞冷冻与活率检验

一.实验目的

1.掌握细胞冷冻解冻原理及方法

2.掌握细胞活率检验原理及方法

二.实验原理

细胞培养液中加冷冻保护剂，并通过一定的冷冻程序冷冻细胞，一方面使细胞内形成的结晶体积较少，减少对细胞的机械性损坏；另一方面缓解细胞内因结晶引起的局部高渗对细胞的伤害。再者，细胞在液氮（-196℃）代谢缓慢，长期保存生命力。通过快速解冻的方法来解冻细胞

三.实验材料

1.材料：牛精子细胞、液氮

2.试剂：2.9%柠檬酸钠DMEM+10%NBS（小牛血清）DMEM+10%NBS+10%DMSO

3.器械：10ml离心管冷冻管水浴锅（37℃）离心机生物显微镜载玻片盖玻片擦镜纸盥水瓶60ml白滴瓶是管家滴管液氮罐纱布袋温度计

四，实验方法

1.细胞解冻：取烧杯一只，加37℃温水，作为解冻源。从液氮罐中取出精子细胞冷冻细管，直接快速投入37℃水浴解冻

2.解冻细胞活率检验：取1支牛精子毛细冷冻管，用75%酒精棉球消毒两端，剪开一端后，置于离心管上，剪开上端，放出精子细胞悬液。加柠檬酸钠缓冲液1ml，混匀，清洗细胞后，离心（1000rpm,5min）弃上清，加DMEM+10%NBS1ml，混匀，制备细胞悬液，取1滴细胞悬液于载玻片上，观察活力，再取一张载玻片，滴一滴细胞悬液和台盼蓝，混匀，静止

1min，计数200个细胞，计算牛精子冷冻解冻活率

3.细胞冷冻：离心稀释细胞，弃上清，加入细胞冷冻保护剂1ml，混匀，进入细胞冷冻管，封口，标记，装袋，放入液氮罐中，悬浮液氮面上过液，投入液氮保存

五．计算细胞活率：细胞活率=活细胞数/200X100%

实习一动物细胞工程常见仪器设备的使用

一.实习目的

通过参观、降解、操作常用仪器，掌握实用实验仪器设备使用方法及注意事项

二.动物细胞工程实验室布局

准备室、层流室、称量室、取材室、储备室

三.仪器及方法

1.准备室实验设备

蒸馏仪：单蒸水、双蒸水、三蒸水

酸缸：酸液由重铬酸钾、蒸馏水、浓硫酸构成，比例是1:20:20

超声波清洗机：洗涤剂刷洗→自来水冲洗→双蒸水冲洗

干燥箱：所有清洗仪器均需烘干，温度设置为75℃。玻璃物品均可采用干燥箱灭菌，通常温度设置为160℃，时间2h

高压灭菌锅：用于消毒塑料物品如墙头、滤器、橡胶管、手术器械等，试剂如PBS，生理盐水等，通常设置为15磅30min

真空泵：用于抽滤，1000ml或以上溶液

离心机：如制备血清，分离细胞

2.层流室的实验设备

超净工作台：操作、细胞分离、培养、传代、冷冻、解冻

CO2培养箱：培养细胞

倒置显微镜：观察细胞生长情况

小型离心机：收集细胞

生化培养箱

CO2瓶

3.称量室的实验设备

电子天平磁力搅拌器药品柜

4.取材室

紫外线提前30min打开无菌取材后及时清理

5.储备室的实验设备

冰箱液氮罐