同步荧光技术

同步荧光光谱用于蛋白质构象的变化： 同步荧光光谱用于蛋白质构象的变化： 色氨酸残基的最大发射波长与其所处环境 的极性有关。 的极性有关。 对于色氨酸残基： 对于色氨酸残基： 红移—环境的疏水性降低— 红移—环境的疏水性降低—肽链的伸展程 度增加 蓝移—环境的疏水性增强— 蓝移—环境的疏水性增强—大分子趋向于 折叠态
PM-19对BSA同步荧光光谱的影响 对 同步荧光光谱的影响
现象：酪氨酸和色氨酸残基荧光同时被猝
灭，相比之下，色氨酸残基的荧光降低比 相比之下， 酪氨酸残基更显著。 酪氨酸残基更显著。最大发射波长几乎没 有改变。 有改变。
结论：PM-19与BSA发生作用的结合位点 与 发生作用的结合位点
更接近色氨酸残基，但是没有改变 更接近色氨酸残基，但是没有改变BSA的 的 疏水腔的疏水环境， 疏水腔的疏水环境，没有改变蛋白质的构 象。
现象：随着 随着Cu(Ⅱ)浓度的增大，酪氨酸残 浓度的增大， Ⅱ 浓度的增大
基特征特征荧光光谱峰和色氨酸光谱峰均 略有红移。 略有红移。
结论：Cu(Ⅱ)的引入使得 的引入使得BSA的构象发生 Ⅱ 的引入使得 的构象发生
了改变， 了改变，使得色氨酸和酪氨酸的残基所处 的微环境疏水性略有减小，表明整个BSA 的微环境疏水性略有减小，表明整个 大分子肽链伸展。 螺旋的含量减少。 大分子肽链伸展。使α-螺旋的含量减少。 螺旋的含量减少
W avelength(nm )
初步结果
现象：随着 2+ 浓度的增加，色氨酸和 随着Hg 浓度的增加，
酪氨酸的同步荧光强度是下降的。 酪氨酸的同步荧光强度是下降的。其中色 氨酸的下降更显著。 氨酸的下降更显著。二者的最大发射峰位 没有太大的变化。 没有太大的变化。 结论： Hg2+ 对KLH的荧光有猝灭作用， 的荧光有猝灭作用， 的荧光有猝灭作用 说明两者有相互作用。并且Hg 说明两者有相互作用。并且 2+ 与KLH 的结合位点更接近色氨酸残基， 的结合位点更接近色氨酸残基，但没有改 的构象。 变KLH的构象。 的构象
同步荧光分析法的应用
2011.12.10
主要内容
简介 实际应用 目前工作
* 同步荧光分析法
常用的荧光测定方法是确定激发（或发射） 常用的荧光测定方法是确定激发（或发射） 波长在一定波长范围内扫描发射（或激发） 波长在一定波长范围内扫描发射（或激发） 光谱。 光谱。 同步荧光扫描技术与常用的荧光测定方法 最大的区别是同时扫描激发和发射两个单 色器波长。 色器波长。由此测得的荧光强度信号与对 应的激发波长(或发射波长)构成光谱图， 应的激发波长(或发射波长)构成光谱图， 称为同步荧光光谱。 称为同步荧光光谱。 习惯上所说的同步荧光是恒波长同步荧光。
-6 -6 -6 -5 -5 -5 -4 -4 -4 -4
∆λ=60nm
Fluorescence intensity/a.u.
30 25 20
∆λ=15nm
a k
12 10 8 6 4 2 0 250 300 350
a k
Intensity
15 10 5 0 -5 200
250
300
350
wavelength(nm)
如测定奶粉中VB1 如测定奶粉中VB1 和 VB6的含量 VB1为 VB6的含量[3]，VB1为 非荧光物质， 非荧光物质，通常测 硫胺素氧化物的荧光 强度， VB1、VB6共 强度， 在VB1、VB6共 存时，光谱部分重叠， 存时，光谱部分重叠， 因此选择合适的波长 差同步扫描， 差同步扫描，方法简 单快速，效果良好。 单快速，效果良好。
∆λ=60nm
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ30 25 20
a k
Intensity
15 10 5 0 -5 200
250
300
350
w a v e le n g t h ( n m )
a - k (m o l/L ): 0 ,1 .0 * 1 0 ,4 .0 * 1 0 ,8 .0 * 1 0 ,1 .0 * 1 0 ,2 .0 * 1 0 ,6 .0 * 1 0 ,1 .0 * 1 0 ,1 .5 * 1 0 ,2 .0 * 1 0 ,2 .5 * 1 0
应用——（一）环境分析 应用
酚是环保检测项目之一， 酚是环保检测项目之一， 通过同步荧光光谱筛选 最佳波长差，消除干扰， 最佳波长差，消除干扰， 对酚经行定量测定， 对酚经行定量测定，并 用于大气中酚的测定[1]。 杜娟等用同步荧光分析 法测定工业及生活废水 中微量十二烷基苯磺酸 钠[2]。
（二）食品检测
进一步工作
1.继续前一步工作，验证所得的初步结果是 继续前一步工作， 继续前一步工作 否正确，找到合适的KLH浓度和 2+浓 浓度和Hg 否正确，找到合适的 浓度和 度。 2.在合适的 在合适的KLH与Hg2+ 浓度比下，做一个 浓度比下， 在合适的 与 时间曲线，找出二者作用时间规律。 时间曲线，找出二者作用时间规律。 3. 做不同温度下的荧光光谱，计算相关热 做不同温度下的荧光光谱， 力学参数。 力学参数。
参考文献
[1]. 王金英 陈淑群 蔡南燕 同步荧光光谱法测定空气中的 王金英, 陈淑群, 蔡南燕. 中山大学学报, 酚[J ] . 中山大学学报 1987, (1) : 109—112 . [2].杜娟 同步荧光法测定废水中微量十二烷基苯磺酸钠 ] . 杜娟. 杜娟 同步荧光法测定废水中微量十二烷基苯磺酸钠[J 日用化学工业, 日用化学工业 2006, (5) : 321—323. [3].胡益水 苏文周 同步荧光法同时测定维生素 和B6[J ] . 胡益水, 胡益水 苏文周. 同步荧光法同时测定维生素B1和 广州食品工业科技, 广州食品工业科技 1994, (2) : 57—60 . [4].刘健 李昭 光诱导人体子宫正常组织 良性肿瘤和恶性肿 刘健, 刘健 李昭. 光诱导人体子宫正常组织, 瘤同步荧光光谱研究[J 应用科学学报, 瘤同步荧光光谱研究 ]. 应用科学学报 1995, 13 (2) : 242—247. [5].梁彦秋 铜（Ⅱ）镉（Ⅱ）、几种小分子同血清蛋白的相 梁彦秋.铜 ）、几种小分子同血清蛋白的相 梁彦秋 互作用研究[D].华东师范大学 华东师范大学,20070401. 互作用研究 华东师范大学
Intensity
20 15 10 5 0 200
250
300
350
400
450
W a v e le n g th (n m )
∆λ=60nm
35
280nm
30 25
Intensity
20 15 10 5 0 200
250
300
350
W a v e le n g th (n m )
∆λ=15nm
同步荧光分析法在研究蛋白质与物质相互 作用主要在两个方面： 作用主要在两个方面： 1.蛋白质分子的内源荧光被猝灭或敏化程 1.蛋白质分子的内源荧光被猝灭或敏化程 度； 2.主要利用色氨酸最大发射波长的位移来 主要利用色氨酸最大发射波长的位移来 判断蛋白质的构象变化。 判断蛋白质的构象变化。
Cu(Ⅱ)对BSA同步荧光的影响[5] Ⅱ 对 同步荧光的影响
-6 -6 -6 -5 -5 -5 -4 -4 -4 -4
∆λ=15nm
Fluorescence intensity/a.u.
12 10 8 6 4 2 0 250 300 350
a k
W a v e le n g t h ( n m )
a -k (m o l/L ):0 ,1 .0 * 1 0 ,4 .0 * 1 0 ,8 .0 * 1 0 ,1 .0 * 1 0 ,2 .0 * 1 0 ,6 .0 * 1 0 ,1 .0 * 1 0 ,1 .5 * 1 0 ,2 .0 * 1 0 ,2 .5 * 1 0
荧光分析法，第三版，许金钩等主编
恒波长同步荧光法是在扫描过程中使激发
波长和发射波长彼此间保持固定的波长间 Δλ）。 隔（Δλ）。 一般Δλ值选择stocks位移值。 Δλ值选择stocks位移值 一般Δλ值选择stocks位移值。 具有简化谱图、提高选择性、灵敏度高、 具有简化谱图、提高选择性、灵敏度高、 减少光散射干扰少等特点。 减少光散射干扰少等特点。 较多用于多组分物质的测定或者一种组分 在常规测试条件下受到较大干扰时的测定。 在常规测试条件下受到较大干扰时的测定。
目前研究工作进展
钥孔戚血蓝蛋白的同步荧光光谱研究
荧光光谱
固定1.0*10-6mol/L KLH为样品，做荧光 为样品， 固定 为样品 激发和发射光谱。 激发和发射光谱。
35 30 25
280nm 338nm e m is s io n s p e c tr u m e x c ita tio n s p e c tr u m
（三）临床医学
刘健等[4]选择波长差 为60nm 测量了人体 子宫、子宫颈、 子宫、子宫颈、卵巢 正常组织、 正常组织、良性肿瘤 和恶性肿瘤的同步荧 光光谱， 光光谱， 为癌症的 早期诊断提供了更有 快速、 效、快速、准确的新 手段。 手段。
(四)蛋白质 蛋白质
蛋白质的内源荧光 蛋白质中含有的色氨酸、 蛋白质中含有的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸 是所有天然氨基酸中仅有的发荧光基团的氨基酸， 是所有天然氨基酸中仅有的发荧光基团的氨基酸， 这是蛋白质内源荧光的来源。 这是蛋白质内源荧光的来源。 用同步荧光光谱法可以分别获得了色氨酸和 酪氨酸的特征光谱。 酪氨酸的特征光谱。 Δλ=15nm 酪氨酸残基光谱特征 Δλ=60nm 色氨酸残基光谱特征
14
298nm
12 10
Intensity
8 6 4 2 0 250 300 350
W a v e le n g th (n m )
初步实验—汞对 初步实验 汞对KLH同步荧光猝灭 汞对 同步荧光猝灭
固定KLH浓度在 浓度在1.0*10-6mol/L，加入不 固定 浓度在 ， 同浓度的Hg 反应。 同浓度的 2+与KLH反应。 反应 设定∆λ=60nm值 200~450nm范围 设定∆λ=60nm值，在200~450nm范围 扫描同步荧光光谱。 扫描同步荧光光谱。