细胞培养技术 ppt课件
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
1‰新洁尔灭 主要用于器械的浸泡，皮肤和操作室壁面的擦试 消毒（阳离子表面活性剂，能破坏细胞膜，改变 其通透性而起杀菌作用）
慢解冻、融解。使用时，必须将解冻的血清充分 混匀，并且勿将血清置于37℃太久。
青霉素-链霉素溶液
青霉素的工作浓度为100 U/ml，
链霉素的工作浓度为0.1 mg/ml。
分别阻止细菌细胞壁合成及细菌蛋白质的组成，达到 抑制细菌生长的作用，防止污染，对真菌和支原体无 效。
其他实验所需的试剂： 药物（如ATRA）、检测试剂（如MTT）、细胞因子 （如SCF）等
用）的平衡盐溶液（如PBS、D-Hank’s）。 EDTA溶液
一般用其钠盐，可溶性较好。有些组织需要Ca2+ 、Mg2+ 来保持其完整性，EDTA可以螯合这些离子，可使细胞之间 裂解。其作用比胰蛋白酶缓和。使用浓度为0.02%，以无钙、 镁的平衡盐溶液配制 。 胶原酶溶液
主要水解结缔组织中胶原蛋白成分（用胰蛋白酶效果较 差），使用Hanks溶液配置，常用剂量为最终浓度200U/ml （约为1mg/mL）。
湿热（高压蒸气灭菌法）：121℃，20min，破坏微 生物孢子、蛋白变性。（用于大量液体、玻璃器皿、 部分塑料耗材、手术器械等，由工作人员操作）
干热：160℃, 2 小时，高热作用下的氧化作用破坏 微生物（耐高温的玻璃和金属制品）
过滤：0.22μm滤膜过滤除菌（少量试剂）
消毒灭菌方法
化学消毒灭菌法 75%酒精 主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内 的壁面处理（蛋白凝固）（不能擦拭有机玻璃）
血清
提供基本营养物质、激素和各种生长因子、 提供结合蛋白、提供促接触和伸展因子使细胞贴 壁免受机械损伤、对培养中的细胞的起到某些保 护作用。
保存血清最好的方法？ 建议血清保存在-20℃。解冻后存放于4℃时，请 勿超过一个月。 （分装）
如何解冻血清才不会使产品质量受损? 建议从冷冻箱取出后，置于2～8℃冰箱使之缓
一 实验设备
超净工作台，生物安全柜 CO2培养箱 倒置显微镜 离心机 电热恒温水槽 液氮罐 纯水仪 压力蒸汽消毒器 电热干燥箱
超净台
生物安全柜
酒精灯（√），离开要熄灭 ！
酒精灯（×）
CO2培养箱
CO2培养箱设定的条件为 37℃，5％CO2 。
倒置显微镜
离心机
配平
电热恒温水槽
液氮罐
液氮：-196 ℃
纯水仪
压力蒸汽灭菌器 电热干燥箱
由工作人员操作，注意安全！
小结一 实验设备及功能
超净工作台，生物安全柜------操作平台 （酒精灯安全） CO2培养箱-------------------------细胞生长的空间 倒置显微镜-------------------------观察细胞 离心机-------------------------------离心收集细胞 电热恒温水槽----------------------加热 液氮罐-------------------------------冻存细胞 纯水仪-------------------------------制备一级水 压力蒸汽消毒器--------------------灭菌 电热干燥箱 -------------------------烘干器皿
试剂标签要规范
Байду номын сангаас
三 清洗及灭菌
在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感, 均能影响培养细胞的生长
微生物产品附带杂物 上次细胞残留物 非营养成分的化学物质
需要清洗的培养用品:玻璃器皿、部分需要回收的塑料制品。 （包括：浸泡（洁消精）、超声波清洗、冲洗、烘干四个
步骤）
消毒灭菌方法
物理消毒灭菌法 Co60辐射（γ射线）：破坏生物大分子（塑料制品） 紫外线（200-300 nm）：30min，阻止细菌、病毒 核酸合成。（细胞室：用于空气，操作台表面等）
中起调节及控制作用
培养基分类
美国模式培养物集存库 ATCC
• DMEM（高糖，葡萄糖4500 mg/L ）：成纤维、 上皮细胞（293），一些实体瘤（Panc-1），原 代神经元
• DMEM（低糖，葡萄糖1000 mg/L ）：间充质 干细胞，单抗细胞融合
• RPMI 1640： 血液细胞（HL60）、一些实体瘤 细胞（BT474）
二 试剂及耗材
培养基 缓冲液 消化液 血清 其他
o 耗材
培养基
供给细胞营养和促使细胞增殖的基础物质，也是培养细 胞生长和繁殖的生存环境。
成分及作用： • 氨基酸：组成蛋白质的基本单位 • 碳水化合物：能量来源 • 无机盐：帮助细胞维持渗透压平衡 • 维生素：维持细胞生长的生物活性物质，在细胞代谢
酚红：PH指示剂（黄色过酸、紫色过碱）； 酚红可以模拟固醇类激素的作用（特别是雌激素）， 涉及到激素和诱导的实验，建议选用无酚红培养基。
缓冲液（洗涤细胞）
PBS：磷酸缓冲盐溶液——具有pH缓冲作用的等渗盐溶 液 （常规实验皆可用）。（Na2HPO4、KH2PO4、NaCl 和KCl）
D-PBS：杜氏磷酸缓冲液，磷酸盐含量稍低，含有钙镁离 子，用于胚胎学方面的研究。
试剂标注规范
试剂名称 配制浓度 配制人 配制日期
NaCl 0.5 mM 张三 2016.10.21
耗材
培养皿、瓶、孔板 离心管、移液管 枪尖 其他
小结二 试剂及耗材的分类及用途
培养基（成分、分类）
o 耗材（分类、用途）
缓冲液 （PBS、Hanks等）
消化液（分类及应用）
血清（作用、存储及解冻方法）
Hanks：平衡盐溶液——无机盐和葡萄糖浓度接近大部 分动植物细胞的水平，可作为动植物细胞短期培养(几个 小时)。
D-Hank’s：不含钙离子、镁离子、葡萄糖（使用消化液 时） 。
消化液
胰蛋白酶溶液 使细胞间蛋白质水解、细胞离散。使用浓度0.25%。 配制时要用不含Ca2+、Mg2+及血清（对胰酶产生抑制作
细胞培养技术
什么是细胞培养？
细胞培养也叫细胞克隆技术。
通过细胞培养得到大量的细胞或其代谢产物。 因为生物产品都是从细胞得来，所以细胞培 养技术是生物技术中最核心、最基础的技术。
主要内容
实验设备 试剂及耗材 清洗及灭菌 细胞培养
（细胞生长过程，细胞来源，细胞复苏、 传代及冻存，细胞计数，活力测定，细胞污 染）
慢解冻、融解。使用时，必须将解冻的血清充分 混匀，并且勿将血清置于37℃太久。
青霉素-链霉素溶液
青霉素的工作浓度为100 U/ml，
链霉素的工作浓度为0.1 mg/ml。
分别阻止细菌细胞壁合成及细菌蛋白质的组成，达到 抑制细菌生长的作用，防止污染，对真菌和支原体无 效。
其他实验所需的试剂： 药物（如ATRA）、检测试剂（如MTT）、细胞因子 （如SCF）等
用）的平衡盐溶液（如PBS、D-Hank’s）。 EDTA溶液
一般用其钠盐，可溶性较好。有些组织需要Ca2+ 、Mg2+ 来保持其完整性，EDTA可以螯合这些离子，可使细胞之间 裂解。其作用比胰蛋白酶缓和。使用浓度为0.02%，以无钙、 镁的平衡盐溶液配制 。 胶原酶溶液
主要水解结缔组织中胶原蛋白成分（用胰蛋白酶效果较 差），使用Hanks溶液配置，常用剂量为最终浓度200U/ml （约为1mg/mL）。
湿热（高压蒸气灭菌法）：121℃，20min，破坏微 生物孢子、蛋白变性。（用于大量液体、玻璃器皿、 部分塑料耗材、手术器械等，由工作人员操作）
干热：160℃, 2 小时，高热作用下的氧化作用破坏 微生物（耐高温的玻璃和金属制品）
过滤：0.22μm滤膜过滤除菌（少量试剂）
消毒灭菌方法
化学消毒灭菌法 75%酒精 主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内 的壁面处理（蛋白凝固）（不能擦拭有机玻璃）
血清
提供基本营养物质、激素和各种生长因子、 提供结合蛋白、提供促接触和伸展因子使细胞贴 壁免受机械损伤、对培养中的细胞的起到某些保 护作用。
保存血清最好的方法？ 建议血清保存在-20℃。解冻后存放于4℃时，请 勿超过一个月。 （分装）
如何解冻血清才不会使产品质量受损? 建议从冷冻箱取出后，置于2～8℃冰箱使之缓
一 实验设备
超净工作台，生物安全柜 CO2培养箱 倒置显微镜 离心机 电热恒温水槽 液氮罐 纯水仪 压力蒸汽消毒器 电热干燥箱
超净台
生物安全柜
酒精灯（√），离开要熄灭 ！
酒精灯（×）
CO2培养箱
CO2培养箱设定的条件为 37℃，5％CO2 。
倒置显微镜
离心机
配平
电热恒温水槽
液氮罐
液氮：-196 ℃
纯水仪
压力蒸汽灭菌器 电热干燥箱
由工作人员操作，注意安全！
小结一 实验设备及功能
超净工作台，生物安全柜------操作平台 （酒精灯安全） CO2培养箱-------------------------细胞生长的空间 倒置显微镜-------------------------观察细胞 离心机-------------------------------离心收集细胞 电热恒温水槽----------------------加热 液氮罐-------------------------------冻存细胞 纯水仪-------------------------------制备一级水 压力蒸汽消毒器--------------------灭菌 电热干燥箱 -------------------------烘干器皿
试剂标签要规范
Байду номын сангаас
三 清洗及灭菌
在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感, 均能影响培养细胞的生长
微生物产品附带杂物 上次细胞残留物 非营养成分的化学物质
需要清洗的培养用品:玻璃器皿、部分需要回收的塑料制品。 （包括：浸泡（洁消精）、超声波清洗、冲洗、烘干四个
步骤）
消毒灭菌方法
物理消毒灭菌法 Co60辐射（γ射线）：破坏生物大分子（塑料制品） 紫外线（200-300 nm）：30min，阻止细菌、病毒 核酸合成。（细胞室：用于空气，操作台表面等）
中起调节及控制作用
培养基分类
美国模式培养物集存库 ATCC
• DMEM（高糖，葡萄糖4500 mg/L ）：成纤维、 上皮细胞（293），一些实体瘤（Panc-1），原 代神经元
• DMEM（低糖，葡萄糖1000 mg/L ）：间充质 干细胞，单抗细胞融合
• RPMI 1640： 血液细胞（HL60）、一些实体瘤 细胞（BT474）
二 试剂及耗材
培养基 缓冲液 消化液 血清 其他
o 耗材
培养基
供给细胞营养和促使细胞增殖的基础物质，也是培养细 胞生长和繁殖的生存环境。
成分及作用： • 氨基酸：组成蛋白质的基本单位 • 碳水化合物：能量来源 • 无机盐：帮助细胞维持渗透压平衡 • 维生素：维持细胞生长的生物活性物质，在细胞代谢
酚红：PH指示剂（黄色过酸、紫色过碱）； 酚红可以模拟固醇类激素的作用（特别是雌激素）， 涉及到激素和诱导的实验，建议选用无酚红培养基。
缓冲液（洗涤细胞）
PBS：磷酸缓冲盐溶液——具有pH缓冲作用的等渗盐溶 液 （常规实验皆可用）。（Na2HPO4、KH2PO4、NaCl 和KCl）
D-PBS：杜氏磷酸缓冲液，磷酸盐含量稍低，含有钙镁离 子，用于胚胎学方面的研究。
试剂标注规范
试剂名称 配制浓度 配制人 配制日期
NaCl 0.5 mM 张三 2016.10.21
耗材
培养皿、瓶、孔板 离心管、移液管 枪尖 其他
小结二 试剂及耗材的分类及用途
培养基（成分、分类）
o 耗材（分类、用途）
缓冲液 （PBS、Hanks等）
消化液（分类及应用）
血清（作用、存储及解冻方法）
Hanks：平衡盐溶液——无机盐和葡萄糖浓度接近大部 分动植物细胞的水平，可作为动植物细胞短期培养(几个 小时)。
D-Hank’s：不含钙离子、镁离子、葡萄糖（使用消化液 时） 。
消化液
胰蛋白酶溶液 使细胞间蛋白质水解、细胞离散。使用浓度0.25%。 配制时要用不含Ca2+、Mg2+及血清（对胰酶产生抑制作
细胞培养技术
什么是细胞培养？
细胞培养也叫细胞克隆技术。
通过细胞培养得到大量的细胞或其代谢产物。 因为生物产品都是从细胞得来，所以细胞培 养技术是生物技术中最核心、最基础的技术。
主要内容
实验设备 试剂及耗材 清洗及灭菌 细胞培养
（细胞生长过程，细胞来源，细胞复苏、 传代及冻存，细胞计数，活力测定，细胞污 染）