高效广谱抗菌肽制剂的研制可行性研究报告

“高效广谱抗菌肽制剂的研制”的可行性研究报告

罗玉萍

南昌大学

一、选题的必要性

1、项目所处技术领域产业政策；

自从青霉素被发现以来，人们对病原菌引起的感染性疾病不再束手无策，特别是β-内酰胺类抗生素的发现，对病原菌感染性疾病的治疗产生了革命性飞跃，抗生素已成为临床治疗病原菌感染的强有力武器。但是，随着抗菌药物的广泛应用和滥用，耐药菌株不断增加，使抗感染治疗陷入耐药菌危机之中。为了应对耐药菌感染，人们一方面对传统抗生素进行结构改造以降低细菌的耐药性，另一方面正在不断研究和开发新型抗菌药物。近年来出现的抗菌肽（antibacterial peptides）就是一类具有巨大发展潜力的新型抗菌药物，它是宿主产生的一类抵抗外界病原体感染的小分子阳离子肽，广泛存在于昆虫、植物、动物及人体内，具有非特异性抗细菌、真菌、病毒等病原体作用，还有抗肿瘤细胞作用，因此又称为肽抗生素(peptide antibiotics)。抗菌肽抗菌谱广，对多重耐药菌、肿瘤细胞、艾滋病毒有杀伤作用，甚至还可能有抗重症急性呼吸综合征(severe acute kespiratory syndrome,SARS)病毒的作用。因此有着广阔的开发应用前景，是目前国际学术研究的活跃领域之一。

抗菌肽的抗菌机制与传统抗生素不同，传统抗生素是与病原体特定部位的受体结合从而使病原体的正常结构遭到破坏或使某些生物合成受阻，以达到抑菌或杀菌的作用，当抗生素作用的靶位点发生改变时，抗生素就会失去其抗菌作用，病原微生物往往通过基因突变改变抗生素靶位点而产生对抗生素有抗性的耐药菌株；抗菌肽对病原体的作用则完全是物理作用。由于抗菌肽具有疏水和亲水的两亲性特征，通过其双亲性正电荷与细胞膜磷

脂分子上的负电荷形成静电吸附而结合在细胞的磷脂膜上，随后抗菌肽分子的疏水端插入细菌细胞膜的脂质膜中,进而造成细胞膜穿孔，使细胞质外溢而达到杀菌的目的。由于抗菌肽与细菌细胞膜的结合不需要膜上特定的受体，因此不会诱导产生抗药菌株和交叉抗性，有望给临床医学、药学、食品加工、动物和植物转基因技术等领域带来广阔的开发应用前景。

鱼类生活在水环境中。由于环境的破坏，自然水体和养殖水体污染日益严重，水体中病源微生物种类和含量在不断增加。面对复杂的生存环境，鱼类在生存过程中需要不断地同大量的病原微生物作斗争。但是，由于鱼类没有B或T淋巴细胞，体液因子中也没有免疫球蛋白的存在，在消灭入侵的微生物时，抗菌肽就起到了至关重要的作用。因此，鱼类先天免疫系统中极有可能存在高效广谱的生物抗菌肽。我们在前期工作中克隆了高效广谱的鱼类抗菌肽基因，本项目拟通过酵母表达获得抗菌肽，并将抗菌肽添加到饲料中，为日益严重的鱼类和畜禽病害防治开辟新的途径。

2、项目所处技术领域技术发展现状；

由于抗菌肽具有独特的抗菌机制，广谱的杀菌作用，高效的抗菌活性以及靶菌株难以产生抗性等优点，因此有着广阔的开发应用前景，是目前国际学术研究的活跃领域之一。计算机检索表明，国外的科学家作了大量的工作，对抗菌肽的研究已经取得了许多进展。法国科学家蒂马克先生于1999年1月创建了Entomed 公司，目的是尽可能得到不同类型的抗菌肽分子。迄今国外科学家已在不同生物中发现了多种抗菌肽，我国在抗菌肽的研究方面起步较晚，仅有少量报道。大量结果显示不同的抗菌肽其抗菌活性和抗菌谱存在很大的差异，因此继续寻找高效广谱的生物抗菌肽，是广大生命科学工作者努力的方向。

3、项目技术先进性，对相关领域技术进步的推动作用；

本项目采用的是先进的分子生物学研究技术。用基因克隆技术将我们从鱼肝脏中分离的抗菌肽基因与具有高效表达启动子的表达载体连接，构建重组DNA分子。然后用醋酸锂法将重组

DNA分子转入解脂耶氏酵母中，筛选高效表达抗菌肽的工程菌，以工程菌工业化发酵生产抗菌肽，进而开发出高效广谱的新型抗菌剂。该项目的实施对相关领域技术进步有一定的推动作用。

4、项目目前进展情况。

我们已进行了前期工作，用引起人畜共患病的多种微生物诱导鱼，继而采用mRNA差异显示技术从经微生物诱导的鱼的肝脏中分离到了三个特异表达的mRNA分子，并使用RACE(rapid amplification of cDNA ends)-PCR技术克隆了它们的全长基因。

这些工作为本项目的实施奠定了基础。

二、技术方案论述

1、项目技术关键点或创新点论述，项目完成时达到的技术水平；

目前,人们主要以两种方法获得抗菌肽。其一是直接从生物体内分离抗菌肽，用这种方法不能获得大量的抗菌肽。其二是根据已发现的抗菌肽基因的序列设计引物在不同的生物中通过PCR 技术克隆抗菌肽基因，该方法只能在不同生物中获得该抗菌肽的同源基因，而不能获得新的抗菌肽基因。在本项目中，我们将前期工作中获得的抗菌肽基因与载体连接，构建抗菌肽酵母高效表达体系，以工程菌工业化发酵生产抗菌肽，用这种方法可获得大量新的高效广谱抗菌肽。

计算机检索结果表明，人们对昆虫抗菌肽进行了较多的研究，而对鱼类抗菌肽研究很少。目前国内只有厦门大学最近采用传统方法从海水养殖的鲈鱼中分离出一种抗菌肽基因，但并未对该基因的表达及其产物的抗菌活性进行分析，也没有开发出基于鱼类抗菌肽基因的广谱抗菌肽制剂。本项目将开发出具有自主知识产权的新型抗菌肽制剂。

项目完成时至少可达到国内领先水平。

2、项目技术方案论述：生产技术、工艺流程、主要技术参数；

将采用RACE-PCR技术从鱼类克隆的抗菌肽全长基因与表达载体连接→构建重组载体→重组载体转入酵母→筛选抗菌肽高效表达酵母体系→大量表达抗菌肽→抗菌肽的抗菌活性和抗菌谱测定→抗菌肽作为饲料添加剂进行动物实验

（1）重组表达载体的构建

将我们从淡水鱼中诱导表达的抗菌肽基因与具有高效表达启动子的表达载体连接，构建重组表达载体。

（2）抗菌肽基因酵母表达体系的构建及高效表达系统的筛选

①采用醋酸锂法将重组载体转入解脂耶氏酵母，构建抗菌肽基因

酵母表达系统。

②采用Northern blot法和Western blot法从转录和翻译两个

水平上筛选抗菌肽高效表达酵母。

（3）抗菌肽的大量表达。

利用筛选到的高效表达酵母菌发酵产生抗菌肽。

（4）抗菌肽的分离纯化。

离心收集表达上清液,采用硫酸铵沉淀抗菌肽。经Sephadex G2100层析，收集各个洗脱峰,用15%的SDS-PAGE分析鉴定目的多肽所在的峰。将含有目的多肽的洗脱液用PBS透析,冻干浓缩。多肽于-70℃保存,用于分析鉴定及生物功能试验。

（5）抗菌肽的抗菌活性和抗菌谱测定。

采用琼脂扩散纸片法。以大肠杆菌沙门氏菌,肠球菌、链球菌、分枝杆菌、巴氏杆菌、布鲁氏菌、弧菌、痢疾杆菌、绿脓杆菌、梭状芽孢杆菌、李氏杆菌、巨大芽孢杆菌、醋酸钙不动杆菌、金黄色葡萄球菌、化脓链状球菌、流感病毒、疱疹病毒为受抑菌。

将大肠杆菌等受抑菌培养后分别加入到平皿中,用玻璃刮铲将菌液涂布均匀,再将浸透被测样品液的滤纸片放在培养基的表面,标记后置于恒温箱中培养，观察抑菌效果,测定抑菌圈直径，了解抗菌肽的抗菌谱。

（6）将抗菌肽作为饲料添加剂进行动物实验。