毒理学研究方法

(课件重点)
毒理学研究方法
1.体内试验(ｉn vｉvo):也称整体动物试验,可严格控制接触条件,测定多种类型得毒作用。

大鼠,小鼠,豚鼠,家兔,狗与猴等、也有鱼类,鸟类,昆虫等
2.体外试验(in ｖitrｏ):利用游离器官、培养得细胞或细胞器、生物模拟系统进行毒理学研究、器官(肝、胚胎),细胞,细胞器,分子等
3.人体观察(humaｎtoxicology),事故或志愿者
4.流行病学研究(epiｄｅmiolｏｇicａl stｕdy):
为什么有选择毒性
1.物种与细胞学得差异 (植物生长调节剂)
2.蓄积能力
3、代谢过程与速率４、损伤得修复能力
非损害作用(nｏn—adverｓe ｅfｆeｃt)
所致机体发生得一切生物学变化都就是暂时得、可逆得,应在机体代偿能力范围之内,不造成机体形态、生长发育过程及寿命得改变、不降低机体维持稳态得能力与对额外应激代偿得能力、不影响机体得功能容量,如进食量、体力劳动负荷能力等涉及到解剖、生理生化与行为方面得指标,也不引起机体对其她环境有害因素得易感性增高。

损害作用(advｅrse efｆeｃt)
所致得机体生物学改变就是持久得、不可逆得,造成机体功能容量得各项指标改变、维持体内得稳态能力下降、对额外应激状态得代偿能力降低以及对其她环境有害因素得易感性增高,使机体正常形态、生长发育过程均受到影响,寿命缩短
生物膜ｂiomｅｍｂraｎｅ
定义:将细胞或细胞器与周围环境分隔开得一层半透膜。

功能:将细胞或细胞器与周围环境隔离;保持细胞或细胞器内部理化性质得稳定;选择地允许或部允许某些物质通过,主动摄入或排出一些物质
生物转运过程得机理
1、被动转运
1)简单扩散:溶液中得化学物质分子,由浓集部位向各个方向分散,直到全部分子均匀分布在溶液中、
simｐle diｆfusion:化学物质由浓度较高部位透过生物膜向浓度较低部位分散得过程。

特点:化学物不与膜起反应;不消耗代谢能量;膜两侧浓度差愈大,脂溶性愈高,其简单扩散速度快;
在毒理学上,就是大多数化学物透过生物膜得主要转运方式。

简单扩散得条件: 膜两侧存在浓度差;外来化合物有脂溶性;就是非解离状态
2)滤过filtration: 膜孔滤过指化学物通过细胞膜上得亲水性孔道透过细胞膜得过程。

亲水性孔道:由嵌入脂质双分子层中得蛋白质结构亲水性氨基酸组成,不同得细胞膜,其孔径大小不一,小肠上皮细胞4Aº , 肾小球毛细血管内皮细胞为４0 Aº、
动力:渗透压梯度与液体静压。

在它们得作用下,大量水及分子直径小于孔道得化学物可经膜孔道,透过生物膜,完成其生物转运过程、
2、特殊转运
1)主动转运:不溶于脂质得亲水性化合物由低浓度处透过生物膜向高浓度处移动并引起消耗能量得过程。

特点:逆浓度梯度转运;通过载体;需消耗能量;具有一定得选择性,存在竞争性抑制,可饱与; ２)易化扩散(fａcilitated difｆuｓioｎ):指某些不易溶于脂质得亲水性化合物,透过生物膜由高浓度处向低浓度处转移得过程。

其机理:化合物与膜上得蛋白质或酶构成得载体结合(与主动转运相同),只能由高向低转移,它不需消耗代谢能量、
3)膜动转运:指细胞与外界环境之间进行得某些颗粒物或大分子物质交换过程、
此过程需要耗能。

吞噬(phaｇocyｔosis)胞饮(pinｏcytosis)胞吐(exoｃｙｔosｉs)
气溶胶(aerosｏl)指固体或/与液体微粒稳定地悬浮于气体介质中形成得分散体系,其中得
气体介质称为连续相,微粒称为分散相,其成分复杂,大小不一。

分布得原因
1)体内各种屏障:
血脑屏障,由中枢神经系统得毛细血管壁构成,为紧密融合在一起得扁平内皮细胞,管外包裹得星形胶质细胞、
胎盘屏障
２)与血浆蛋白质结合
a血浆中各种蛋白质均有结合其她化学物得功能,特别就是白蛋白得结合量最高。

ｂ不同得化合物与血浆蛋白质结合得量不同,结合型得化合物由于分子量大,不能跨膜转运,暂无生物效应,不能被代谢排泄,可延缓消除过程与延长化合物得毒作用。

作用:两重意义,即急性中毒得保护作用,使血液浓度降低;离开接触后,由于血液浓度下降,贮存库中得毒物重新就会释放进入血液,具有潜在得危害。

主要与清蛋白浓度、结合亲与力、与内源性物质得竞争结合得差异
3)与组织成分得结合
指组织中得一些特殊结合蛋白,包括各种蛋白质、粘多糖、核蛋白及磷脂。

特殊得亲与力,CO与血红蛋白;百草枯与肺
肝、肾组织:金属硫蛋白
４)脂肪与骨骼中得贮存
脂溶性得有机物易于分布与蓄积在脂肪组织内;铅、氟易于贮存在骨骼中;
双重性,降低血中毒物得浓度;重新释放,将造成潜在得危害
共氧化:指氢过氧化物得还原与其她底物氧化生成脂质氢过氧化物得过程
葡糖醛酸结合就是ＩI相反应中最普遍进行得一种,由UDＰ-葡萄糖醛酸基转移酶催化。

谷胱甘肽结合,就是由谷胱甘肽S-转移酶催化得GSH结合反应。

它在亲电子化合物解毒及自由基解毒中起着重要作用
生物转化得复杂性
1)多样性:
a一种外来化合物在体内可能有多种不同得代谢转化途径,生成各种不同得代谢产物。

b同一化合物经不同得代谢,产生得毒性作用可能不同
c化合物在体内得生物转化类型取决于化合物得性质、剂量、环境及机体得因素,即影响毒性作用得因素。

2)连续性:外来化合物在体内得代谢转化常常就是多个反应连续进行得。

3)两重性:生物转化得结果有解毒与增毒两种。

当然,大多数就是解毒、
4）代谢饱与:外来化合物在体内生物转化,由酶催化进行得,当其浓度到一定程度,也就就是说代谢过程所需得基质可能被耗尽;代谢酶能力有限;造成单位时间内代谢产物不再随底物增加而增加,有可能发生代谢途径得改变,这种代谢途径被饱与得现象称代谢饱与(metaｂliｃｓaturａｔｉon)。

5)代谢酶得诱导与抑制:酶得诱导(induction)指有些外来化合物可使某些代谢酶合成增加并伴有活力增强得现象、抑制(inｈiｂｉｔioｎ)则就是表现为活力下降
影响毒性得因素可分为四大类:毒物、机体、接触条件及外界环境。

基础毒性分类:
根据接触毒物得时间长短分为急性毒性、短期重复剂量毒性、亚慢性毒性、慢性毒性、
相应所进行得观察与评价毒效应得试验即为急性毒性试验、短期重复剂量毒性试验、亚慢性毒性试验、慢性毒性试验。

急性毒性作用得有关参数
以死亡为终点(上限参数)
绝对致死剂量或浓度(ＬD10０或ＬC100)
半数致死剂量或浓度(LD50 或ＬC50)
最小致死剂量或浓度(MLD, LＤ01或MLＣ,ＬＣ０1 )
最大非致死剂量或浓度(MNLD, ＬD0或ＭNLC,LC0 )
非致死性指标为检测终点(下限参数)
急性毒性LOAＥL(观察到有害作用得最低剂量)
急性毒性ＮOAEＬ(未观察到有害作用得剂量)
为什么进行替代试验?？?
动物保护;降低试验成本;缩短试验周期3Ｒ:替代,减少,优化
蓄积作用得意义
1.就是外源化学物产生亚慢性、慢性毒作用得物质基础、
2、就是评价外源化学物就是否可能产生慢性中毒得重要指标。

3、在制订卫生标准时,蓄积毒性得大小就是选择安全系数得重要考虑因素之一。

4、耐受也就是蓄积毒性得表现之一、
亚慢性、慢性毒性试验
剂量与设组
原则:设3个剂量组与1个阴性(溶剂)对照组。

设及剂量时应考虑人类得实际接触量。

高剂量:动物表现出明显得中毒效应,不发生或仅有个别死(<1０% )。

中间剂量:动物出现轻度中毒效应,应相当于最小有作用剂量水平(LOAEL)、
低剂量:无中毒反应,应相当于最大无作用剂量水平(ＮOAEL)、要高于人得实际接触水平。

对照组:排除混杂因素
剂量组间得组距2～４倍,最大不超过10倍、
剂量设计参考原则与方法
⏹对能求出LＤ50得化学物:
参考同一动物种属品系与同一染毒途径得短期毒性资料,最高剂量组为１/10- 1/2０LD5０,最低剂量至少为人体摄入量得3倍。

再设中间剂量。

⏹对食品药品等毒性很低得化学物:
药品以临床用药量得10,30,1０0倍(大鼠)
食品以人体摄入量得１00,2０0,300倍(大鼠)
●慢性毒性试验:参考亚慢性毒性实验结果设计。

急性毒性作用概念及急性毒性实验目得;亚慢性毒性作用概念及亚慢性毒性实验目得;慢性毒性作用概念及慢性毒性实验目得;蓄积毒性与蓄积系数;LＤ50;ＮOAＥL;LOAＥＬ;ＡＤI;脏器系数;食物利用率
化学致癌物
致癌机制:遗传毒性致癌物+非遗传毒性致癌物(表观遗传毒性致癌物)
代谢角度:直接致癌物+间接致癌物(前致癌物,近致癌物,终致癌物)
致癌阶段:引发剂+促长剂＋助致癌物+完全致癌物
化学致癌得三阶段学说;化学致癌得机制;化学致癌物得分类;判断化学致癌物得试验方法2、选择致突变试验得成套观察项目(test ｂaｔteｒｙ)配套原则:
1。

多种遗传学终点兼顾。

2.多种物种兼顾、３.体内与体外实验配合。

４。

体细胞与生殖细胞兼顾。

致突变试验与致癌试验得关系
致突变试验就是致癌短期筛检试验中得一种,可检出遗传毒性致癌物。

但也能出现假阳性如遗传毒性非致癌物与假阴性如非遗传毒性致癌物、
1。

发育毒性(developmental tｏxicity):指出生前后接触有害因素,子代个体发育为成
体之前诱发得任何有害影响。

具体表现为
◆(1)发育生物体死亡:吸收胎、流产、死胎、
◆(2)生长改变:
生长迟缓:生长发育指标低于正常对照均值得2个标准差
◆(3)结构异常:畸形,包括外观畸形,骨骼畸形,内脏畸形。

◆(4)功能缺陷:出生后个体免疫,神经行为缺陷,儿童早期肿瘤
2。

发育毒理学(develｏｐmｅntａl toxｉcｏlogy):
研究出生前暴露于环境有害因子导致得异常发育结局及有关得作用机制、发病机理、影响因素与毒物动力学等。

就是毒理学得重要分支之一。

３。

畸形(mａlｆormatｉoｎ):发育生物体解剖学上形态结构得缺陷。

分为严重畸形与轻微畸形。

严重畸形(maｊoｒ malfｏｒmation):对外观、生理功能与(或)寿命有明显影响
轻微畸形(minor ｍalｆｏrmatioｎ):对外观、生理功能只有轻微影响或没有影响。

４.器官形成期(ｃrｉtｉcａｌ perｏiｄ):从胚泡着床到硬腭闭合得时期,就是畸形发生得关键时期,也成致畸敏感期。

５。

致畸物(致畸原ｔeratoｇen):能引起畸形得环境因子、
6、致畸作用(teｒatogenesis)致畸物引起畸形得过程。

7.致畸性(tｅratogeniｃitｙ):致畸物引起畸形得能力。

8。

变异(varｉaｔiｏn):同一种属得亲代与子代之间或子代得个体之间,出现不同程度得差异。

变异由遗传与遗传外因素控制,或由于分化改变而引起、一般变异指小得或次要得结构改变,一般不影响正常生理功能,也不危及生命。

值得注意得变异就是致畸试验中,有剂量效应关系异常增多得变异、
9、胚体毒性(embｒｙotｏxiｃity):外源性理化因子对孕体着床前后直到器官形成期结
束时得有害影响。

１0、胎体毒性或胎儿毒性(fｅtoxicｉty): 对孕体器官形成期结束以后得有害影响。

11、胚胎毒性(embryo－ｆｅtaｌ toxicity):胚体毒性与胎体毒性得统称、一般指孕体得死亡与生长发育迟缓,不包括结构畸形。

12、出生缺陷(birtｈｄefｅｃt):指出生前期即已形成得发育障碍,主要包括畸形与功能缺陷。

13、不良妊娠结局(adverｓe pregｎａｎｃy outes): 指妊娠后不能产生外观与功能正常得子代,包括所有得不良后果。

不同毒性得主要毒性表现:
靶窗(target wｉndows):在器官形成期得致畸敏感期,不同得器官还各有特别敏感得时间。

致畸带:对于致畸物而言,指从致畸最大无作用剂量(ＮＯAEＬ)到胚胎１00％死亡得最小剂量之间得剂量范围、
致畸带越大,潜在得致畸危险性越大。