氧自由基的分析研究进展
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四、化学发光法 与电子自旋共振和高效液相色谱等方法比
较， 化学发光法操作简便， 不需昂贵仪器， 测定快 速。徐向荣等［１７］以酵母作为发光底物， 用化学发 光法测定了 Ｆｅ２＋－ Ｈ２Ｏ２ 体系产生的 ＯＨ·， 并用与 模拟染料废水处理中 ＯＨ·的测定。陈季武等［１８］用 酵母扩增（ ＯＨ·进攻酵母， 从酵母壁中获取电子， 同时伴随化学发光）， 化学发光测定抗坏血酸 － Ｃｕ２＋－ Ｈ２Ｏ２ 体 系 产 生 的 ＯＨ·， ＯＨ·的 清 除 剂 硫 脲， 苯甲酸均能有效抑制发光， 用该法可以筛选 清除 ＯＨ·的药物。张健等［１９］用 ＣｕＳＯ４－ Ｐｈｅｎ－ Ｖｃ－ Ｈ２Ｏ２ － ＤＮＡ 化学发光体系测 定 了 羟 基 自 由 基 的 损伤作用及茶多酚对 ＤＮＡ 的保护作用。此方法 的 缺 点 是 特 异 性 不 高 ， Ｈ２Ｏ２ 也 可 攻 击 酵 母 产 生 化 学 发 光， 但 与 ＯＨ·相 比 ， Ｈ２Ｏ２ 诱 发 的 发 光 极 弱。李益新等［２０］用黄嘌呤或次黄嘌呤－ 黄嘌呤氧 化酶 － 鲁米诺作为 Ｏ２－·发生与发光体系， 此方 法响应时间短， 可以在测量部位上注入反应液启 动反应， 立即监测。Ｃｈｏｉ 等［２１］在黄嘌呤 － 黄嘌呤 氧化酶体系产生 Ｏ２－·的基础上， 建立了流动注射 化学发光法测 ＳＯＤ 活性， 流动相为含有 ５μＭ 光 泽精和 ０．３ｍＭ 黄嘌呤的 ５０ｍＭ 磷酸钾缓冲溶液 （ ｐＨ ７．４） 。牛血清蛋白在 １￣１０００ｇ／ｍＬ 的范围内 不影响测定， 可在 ３０ｓ 内测定一份样品。但样品 中抗坏血酸等还原性物质会影响 ＳＯＤ 活性的测 定。
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ＯＨ·含量。但是该法操作繁琐， 灵敏度和重现性 均较差。Ｌｕｏ 等［１６］用水杨酸作探针， 萃取水杨酸 盐羟基化的产物和相关的化合物， 转移至三甲基 硅烷衍生物中。衍生物用气相色谱分离， 质谱检 测。以安息香作为内标定量。在人体血浆内的回 收率是 ９０￣１０２％， 检测限为 ５０ｆｍｏｌ￣１ｐｍｏｌ。日内 和日间的变异系数为 ４．６￣９．１％。该法可用于自 由基药物领域、阿司匹林及其代谢的药理学研 究。
液氮（ ７７Ｋ） 低温保存 ＯＨ·与 捕 获 剂 形 成 的 自 旋 加合物， 发现 ３－ ４ 天后， 自旋加合物的浓度基本 不变， 即延长了自旋加合物的寿命。对于没有 ＥＳＲ 测量条件而不能实时进行 ＥＳＲ 测定的短寿 命自由基， 可以选用本方法， 选择合适的捕集剂， 捕集后立即置于液氮中保存， 需要时即取出解冻 测 量 。Ｐｏｕ 等［５］利 用 过 量 乙 醇 与 ＯＨ·反 应 生 成 ·ＣＨ （ ＣＨ３） ＯＨ 自由基， 然后利用 ４－ ＰＯＢＮ （ ４－ ｐｙｒｉｄｙｌ－ １－ ｏｘｉｄｅ－ Ｎ－ ｔｅｒｔ－ ｂｕｔｙｌｎｉｔｒｏｎｅ） 捕集形成一 个 相 应 的 自 旋 加 合 物 ， ·ＣＨ （ ＣＨ３） ＯＨ 与 ４ － ＰＯＢＮ 的 反 应 速 率 是 其 与 ＤＭＰＯ 或 ＰＢＮ 的 １０ 倍， ４－ ＰＯＢＮ－ ＣＨ（ ＣＨ３） ＯＨ 的 稳 定 性 比 用 ＤＭＰＯ 捕集生成相应的自旋加合物更强， 因此该方法的 灵 敏 度 高 。 李 占 魁 等［６］以 ＤＭＰＯ（ ５，５－ ｄｉｍｅｔｈｙｌ－ ｐｙｒｒｏｌｉｎｅ－ ｌ－ ｏｘｉｄｅ） 为自旋捕捉剂， 采用 ＥＳＲ 自旋 捕捉法检测血清 ＳＯＤ 活性， 具有电子自旋共振 波谱技术直接测量及快速敏捷的优点， 又有误差 小 、灵 敏 度 高 、检 测 样 品 不 受 破 坏 和 对 化 学 反 应 无干扰等优点。
六、分光光度法 用 ＥＳＲ、ＨＰＬＣ、ＧＣ 等方法测定 ＯＨ·， 所需 仪器昂贵， 操作也较复杂， 一般实验室难以应用。 化学发光法和荧光法的灵敏度比分光光度法高， 但其仪器远不如分光光度计普及。用分光光度法 测定 ＯＨ·， 方法简便实用， 易为一般实验室所采 用。但应该注意方法的选择性。杨春维等［２８］基于 噻 嗪 类 指 示 剂 与 ＯＨ·生 成 无 色 加 合 物 的 特 性 ， 以 亚 甲 基 蓝 为 例 ， 在 ６６０ｎｍ 比 色 法 测 定 Ｆｅ２＋－ Ｈ２Ｏ２ 体系产生的 ＯＨ·， 建立了检测环境模拟水 相中羟基自由基的方法。程丽华等［２９］根据邻二氮 菲 － Ｆｅ２ ＋ 被 ＯＨ·氧 化 为 邻 二 氮 菲 － Ｆｅ３ ＋ 后 ， 其 ５０８ｎｍ 最大吸收峰消失， 比色法测定 Ｆｅｎｔｏｎ 反 应产生 ＯＨ·的表观生成速率。吴南等［３０］研究了用 茜 素 紫 的 氧 化 来 显 色 测 定 Ｆｅｎｔｏｎ 反 应 产 生 的 ＯＨ·， 于 ５６０ｎｍ 处测定吸光度的变化， 抗氧化剂 药物甘露醇、苯甲酸与羟基自由基具有明显的量 效关系， 对筛选清除 ＯＨ·的天然抗氧化剂， 研究 清除自由基的机理有一定的应用价值。徐向荣等 ［３１］ 用二甲亚砜捕获 ＯＨ·生成的甲基亚磺酸与坚 牢蓝 ＢＢ 盐反应生成偶氮砜， 于 ４２０ｎｍ 比色测定 其含量间接测定 ＯＨ·， 该法还测定了核桃、黑芝
摘要： 本文对氧自由基的分析测定方法进行了综述和评价， 主要包括电子自旋共振、高效液 相色谱法、分光光度法、化学发光法、荧光和电化学等方法。 关键词： 羟基自由基； 超氧阴离子自由基； 综述 中图分类号： Ｏ６５ 文献标识码： Ａ 文章编号： ＣＮ１１－ ５３４０ ／Ｎ（２００７）０１－ ０００３－ ０５
＊ 收稿日期： ２００７－ ０１－ １８ ＊＊ 作者简介： 王炳娟（ １９８３－ ） ， 女， 山西晋城市人， 首都师范大学化学系研究生。
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北京教育学院学报（ 自然科学版）
剂， 如二甲亚砜、苯丙氨酸、水杨酸等。Ｆｕｋｕｉ 等［７］ 用 ＤＭＳＯ 捕获 ＯＨ·生成甲基亚磺酸， 再同坚牢 黄 ＧＣ 盐反应生成 ２－ 氯苯重氮甲砜。用乙酸乙 酯萃取后， Ｃａｐｃｅｌｌ－ ＰａＫ ＮＨ２ 柱， 乙醇－ 正己烷（ ３： １００） 作流动相分离， ２８５ｎｍ 检测。检测限为 ８ｎｇ／ ｍＬ， 在牛肝匀浆中的加标回收率大于 ７０％。该法 适用于 Ｆｅｎｔｏｎ 反 应 和 次 黄 嘌 呤－ 黄 嘌 呤 氧 化 酶 系统中产生的 ＯＨ·的测定。Ｔａｉ 等［８］用 ＤＭＳＯ 捕 获 ＯＨ·生成甲醛， 再同 ２， ４－ 二硝基苯肼（ ＤＮＰＨ） 反应生成相应的腙 （ ＨＣＨＯ－ ＤＮＰＨ） 。ＸＤＢ－ Ｃ１８ 柱， 甲醇－ 水（ ６０：４０） 作流动相（ 流速 １ｍＬ／ｍｉｎ） 分 离， 检测限为 ０．５４μｍｏｌ／Ｌ。该法已用于深度氧化 过程中 ＯＨ·的测定。Ｊａｈｎｋｅ 等［９］利用 ＤＭＳＯ 捕捉 ＯＨ·生成甲基亚磺酸， 其测定采取 ＨＰＬＣ 分离电 化学检测。该方法测定甲基亚磺酸的检测限为 ２ｎｍｏｌ／Ｌ。与传统的生色法相比， 该法简单， 灵敏 度高。Ｋａｕｒ 等［１０］用苯丙氨酸捕获 ＯＨ·生成酪氨 酸， Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ Ｃ－ １８ 柱， 含 １０％甲醇的 ０．０５ｍｏｌ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４ （ Ｈ３ＰＯ４ 缓 冲 液 （ ｐＨ３．０） 作 流 动 相 分 离 ， ２７４ｎｍ 检测。邻、间、对位的酪氨酸和苯丙氨酸及 它的代谢产物得到很好的分离。该方法已用于早 产儿血液中 ＯＨ·的测定。Ｄａｓ 等［１１］为了测定在心 肌局部缺血再灌注时可能产生的羟基自由基， 采 用 Ｌａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ 技术灌注离体的老鼠的心脏。将 水杨酸加入到灌注通路中， 用来捕捉 ＯＨ·形成 ２， ５－ 和 ２， ３－ 二 羟 基 苯 甲 酸 。 Ａｌｔｅｘ Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ ＯＤＳ 柱， 含醋酸钠和柠檬酸的缓冲液作流动相， Ｍｏｄｅｌ ４６０ 电化学检测器， Ａｇ／ＡｇＣｌ 作参比电极， 在 ０．６Ｖ 检测。这些结果也为心脏中 ＯＨ·的存在 提供了证据。
第 ２ 卷第 １ 期 ２００７ 年 ２ 月
北京教育学院学报（ 自然科学版） ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＥＩＪＩＮＧ ＩＮＳＴＴＴＵＴＥ ＯＦ ＥＤＵＣＡＴＩＯＮ（ ＮＡＴＵＲＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥ）
Ｖｏｌ．２ Ｎｏ．１ Ｆｅｂ．２００７
氧自由基的分析研究进展 ＊
王炳娟 ＊＊
（ 首都师范大学化学系 北京， １ ０００３７）
源自文库
在生命活动的氧化代谢过程中会不断地产 生 各 种 自 由 基 ， 其 中 超 氧 阴 离 子 自 由 基 （ Ｏ２－·） ﹑ 羟基自由基（ ＯＨ·） 和脂自由基（ ＲＯＯ·） 是三种具 有代表性的自由基， Ｏ２－·形成最早， 而 ＯＨ·作用 最强。ＯＨ·是一个氧化能力很强的自由基， 可以 发生电子转移， 夺取氧原子和羟基化等反应， 能 使糖类，氨基酸， 蛋白质， 核酸和脂类等发生氧 化， 遭受损伤与破坏， ＯＨ·与衰老， 肿瘤， 辐射损 伤和细胞吞噬作用有关［１，２］。Ｏ２－·不仅自身具有毒 性， 而且可以经过一系列反应生成其它氧自由 基， 进一步对生物体产生损伤作用。因此，近年来 在基础医学， 临床医学， 预防医学， 药学等领域， 对氧自由基开展了广泛的研究工作。由于氧自由 基的反应活性大， 寿命短， 存在浓度低， 因此在有 关涉及氧自由基的研究中， 其测定方法就显得特 别重要。本文对有关 ＯＨ·及 Ｏ２－·的分析测试方 法进行综述和评价。
除此以外， 还有以酚类［１２］、α－ 松萜［１３，］、苯甲酸 ［１４］等作 ＯＨ·的捕获剂， 用 ＨＰＬＣ 对其羟基化产物 进行分离检测， 也都取得了较为满意的结果。
三、气相色谱法 ＯＨ·与 甲 硫 基 丙 醛 反 应 产 生 乙 烯 ， 或 与 ＤＭＳＯ 反应产生甲烷， 因此可以将甲硫基丙醛或 ＤＭＳＯ 加入到一定的反应体系， 应用气相色谱法 检测所生成的乙烯或甲烷， 判断该反应体系有无 ＯＨ·生成以及测定 ＯＨ·的相对含量。但是， 甲硫 基丙醛也能与其它自由基如 Ｏ２－·反应产生乙烯， ＤＭＳＯ 与 ＯＨ·作用生成的甲烷量也很低， 因此， 许多学者注意到气相色谱法测定 ＯＨ·的专一性 问题。Ｂｅｒｇｈ 等［１５］应 用 α－ 蒎 烯 作 为 ＯＨ·的 捕 获 剂， 用气相色谱法测定氧化产物， 从而间接测定
一、电子自旋共振法 电 子 自 旋 共 振 （ ＥＳＲ） 主 要 的 研 究 对 象 为 具 有未成对电子的自由基和过渡金属离子及其化 合物。自旋捕集（ ｓｐｉｎ ｔｒａｐｐｉｎｇ） 技术的建立为短 寿命自由基的 ＥＳＲ 检测技术开辟了新的途径［３］。 此方法利用自旋捕集剂和短寿命自由基之间的 结合反应， 生成相对稳定的自由基 （ 自旋加合 物） ， 然后进行 ＥＳＲ 测定。由于自旋加合物的寿 命很短， 因此必须在捕集之后立即进行 ＥＳＲ 测 定， 从而限制了许多实验研究。丛建波等［４］采用
二、高效液相色谱法 高效液相色谱法（ ＨＰＬＣ） 测定羟基 自 由 基 ， 在分离检测前需先用捕捉剂捕集自由基， 因此捕 捉剂不但要能捕获所需测定的自由基， 反应产物 具有一定的稳定性， 还要有利于 ＨＰＬＣ 的分离和 检测。用荧光检测， 其灵敏度比紫外可见光检测 要高得多， 但要求捕获自由基后的生成物具有荧 光性质。多种物质均可作为羟基自由基的捕获
王 炳 娟：氧 自 由 基 的 分 析 研 究 进 展
该法研究了一些氨基酸和类黄酮物质清除羟基 自由基的能力。辛淑敏等［２４］根据无荧光的对苯二 甲酸与 ＯＨ·反 应 形 成 强 荧 光 的 羟－ 对 苯 二 甲 酸 加 成 物 ， ３１５ｎｍ 激 发 ， ４２５ｎｍ 检 测 经 物 理 因 素 （ ＵＶ 照 射 ） 及 化 学 因 素 （ Ｆｅｎｔｏｎ 反 应 ） 处 理 后 水 溶液中产生的羟基自由基， 并探讨了血卟啉衍生 物 （ ＨＰＤ） 的 光 敏 作 用 机 理 。 方 光 荣 等［２５］研 究 了 ＯＨ·与 Ｃｅ３＋的 反 应 ， 表 明 在 酸 性 条 件 下 ， 有 强 荧 光的 Ｃｅ３＋被氧化生成无荧光的 Ｃｅ４＋ 。采用流动荧 光注射法测定反应前后荧光强度的下降可间接 测定羟基自由基的量。该方法可作为在线筛选抗 氧化剂以及在线测定羟基自由基的方法。唐波等 ［２６］ 合成了用于 Ｏ２－·识别的新型荧光探针试剂 ２－ 吡啶甲醛苯并噻唑啉， 该探针试剂只能被 Ｏ２－·氧 化， 而共存的双氧水和羟基自由基都不能使其在 测定波长下的荧光发生变化， 所以探针试剂对 Ｏ２－·具有专一性， 由此建立了流动注射 （ 荧光法 测定 Ｏ２－·的方法。此方法可实现 Ｏ２－·和 ＳＯＤ 活 性的实时、在线分析检测。之后他们又合成了新 的荧光探针试剂香 草 醛 缩－ ８－ 氨 基 喹 啉［２７］， 建 立 了新的测定 Ｏ２－·的荧光光度法， 并用于一串红植 物衰老过程中 Ｏ２－·产生速率的测定。
五、荧光分析法 Ｔａｎｇ 等［２２］用流动 注 射 荧 光 法 检 测 对 苯 二 酸 钠－ Ｃｏ２＋－ Ｈ２Ｏ２ 体系产生的 ＯＨ· ， 测定羟基化产 物 ２－ 羟基对苯二酸钠在 ４３１ｎｍ 处的荧光峰值即 可测定体系产生 ＯＨ·的相对量。相对标准偏差 为 ０．５７％。此方法已被用于检测天然食物和玉米 花粉聚糖的抗氧化能力。Ｔａｉ 等［２３］用 ＤＭＳＯ 捕获 ＯＨ·生成甲醛， 再与氨和 １， ３－ 环己二酮反应。产 物发出特征性荧光（ Ｅｘ／Ｅｍ＝４００．４／４５２．３） 。已利用
较， 化学发光法操作简便， 不需昂贵仪器， 测定快 速。徐向荣等［１７］以酵母作为发光底物， 用化学发 光法测定了 Ｆｅ２＋－ Ｈ２Ｏ２ 体系产生的 ＯＨ·， 并用与 模拟染料废水处理中 ＯＨ·的测定。陈季武等［１８］用 酵母扩增（ ＯＨ·进攻酵母， 从酵母壁中获取电子， 同时伴随化学发光）， 化学发光测定抗坏血酸 － Ｃｕ２＋－ Ｈ２Ｏ２ 体 系 产 生 的 ＯＨ·， ＯＨ·的 清 除 剂 硫 脲， 苯甲酸均能有效抑制发光， 用该法可以筛选 清除 ＯＨ·的药物。张健等［１９］用 ＣｕＳＯ４－ Ｐｈｅｎ－ Ｖｃ－ Ｈ２Ｏ２ － ＤＮＡ 化学发光体系测 定 了 羟 基 自 由 基 的 损伤作用及茶多酚对 ＤＮＡ 的保护作用。此方法 的 缺 点 是 特 异 性 不 高 ， Ｈ２Ｏ２ 也 可 攻 击 酵 母 产 生 化 学 发 光， 但 与 ＯＨ·相 比 ， Ｈ２Ｏ２ 诱 发 的 发 光 极 弱。李益新等［２０］用黄嘌呤或次黄嘌呤－ 黄嘌呤氧 化酶 － 鲁米诺作为 Ｏ２－·发生与发光体系， 此方 法响应时间短， 可以在测量部位上注入反应液启 动反应， 立即监测。Ｃｈｏｉ 等［２１］在黄嘌呤 － 黄嘌呤 氧化酶体系产生 Ｏ２－·的基础上， 建立了流动注射 化学发光法测 ＳＯＤ 活性， 流动相为含有 ５μＭ 光 泽精和 ０．３ｍＭ 黄嘌呤的 ５０ｍＭ 磷酸钾缓冲溶液 （ ｐＨ ７．４） 。牛血清蛋白在 １￣１０００ｇ／ｍＬ 的范围内 不影响测定， 可在 ３０ｓ 内测定一份样品。但样品 中抗坏血酸等还原性物质会影响 ＳＯＤ 活性的测 定。
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ＯＨ·含量。但是该法操作繁琐， 灵敏度和重现性 均较差。Ｌｕｏ 等［１６］用水杨酸作探针， 萃取水杨酸 盐羟基化的产物和相关的化合物， 转移至三甲基 硅烷衍生物中。衍生物用气相色谱分离， 质谱检 测。以安息香作为内标定量。在人体血浆内的回 收率是 ９０￣１０２％， 检测限为 ５０ｆｍｏｌ￣１ｐｍｏｌ。日内 和日间的变异系数为 ４．６￣９．１％。该法可用于自 由基药物领域、阿司匹林及其代谢的药理学研 究。
液氮（ ７７Ｋ） 低温保存 ＯＨ·与 捕 获 剂 形 成 的 自 旋 加合物， 发现 ３－ ４ 天后， 自旋加合物的浓度基本 不变， 即延长了自旋加合物的寿命。对于没有 ＥＳＲ 测量条件而不能实时进行 ＥＳＲ 测定的短寿 命自由基， 可以选用本方法， 选择合适的捕集剂， 捕集后立即置于液氮中保存， 需要时即取出解冻 测 量 。Ｐｏｕ 等［５］利 用 过 量 乙 醇 与 ＯＨ·反 应 生 成 ·ＣＨ （ ＣＨ３） ＯＨ 自由基， 然后利用 ４－ ＰＯＢＮ （ ４－ ｐｙｒｉｄｙｌ－ １－ ｏｘｉｄｅ－ Ｎ－ ｔｅｒｔ－ ｂｕｔｙｌｎｉｔｒｏｎｅ） 捕集形成一 个 相 应 的 自 旋 加 合 物 ， ·ＣＨ （ ＣＨ３） ＯＨ 与 ４ － ＰＯＢＮ 的 反 应 速 率 是 其 与 ＤＭＰＯ 或 ＰＢＮ 的 １０ 倍， ４－ ＰＯＢＮ－ ＣＨ（ ＣＨ３） ＯＨ 的 稳 定 性 比 用 ＤＭＰＯ 捕集生成相应的自旋加合物更强， 因此该方法的 灵 敏 度 高 。 李 占 魁 等［６］以 ＤＭＰＯ（ ５，５－ ｄｉｍｅｔｈｙｌ－ ｐｙｒｒｏｌｉｎｅ－ ｌ－ ｏｘｉｄｅ） 为自旋捕捉剂， 采用 ＥＳＲ 自旋 捕捉法检测血清 ＳＯＤ 活性， 具有电子自旋共振 波谱技术直接测量及快速敏捷的优点， 又有误差 小 、灵 敏 度 高 、检 测 样 品 不 受 破 坏 和 对 化 学 反 应 无干扰等优点。
六、分光光度法 用 ＥＳＲ、ＨＰＬＣ、ＧＣ 等方法测定 ＯＨ·， 所需 仪器昂贵， 操作也较复杂， 一般实验室难以应用。 化学发光法和荧光法的灵敏度比分光光度法高， 但其仪器远不如分光光度计普及。用分光光度法 测定 ＯＨ·， 方法简便实用， 易为一般实验室所采 用。但应该注意方法的选择性。杨春维等［２８］基于 噻 嗪 类 指 示 剂 与 ＯＨ·生 成 无 色 加 合 物 的 特 性 ， 以 亚 甲 基 蓝 为 例 ， 在 ６６０ｎｍ 比 色 法 测 定 Ｆｅ２＋－ Ｈ２Ｏ２ 体系产生的 ＯＨ·， 建立了检测环境模拟水 相中羟基自由基的方法。程丽华等［２９］根据邻二氮 菲 － Ｆｅ２ ＋ 被 ＯＨ·氧 化 为 邻 二 氮 菲 － Ｆｅ３ ＋ 后 ， 其 ５０８ｎｍ 最大吸收峰消失， 比色法测定 Ｆｅｎｔｏｎ 反 应产生 ＯＨ·的表观生成速率。吴南等［３０］研究了用 茜 素 紫 的 氧 化 来 显 色 测 定 Ｆｅｎｔｏｎ 反 应 产 生 的 ＯＨ·， 于 ５６０ｎｍ 处测定吸光度的变化， 抗氧化剂 药物甘露醇、苯甲酸与羟基自由基具有明显的量 效关系， 对筛选清除 ＯＨ·的天然抗氧化剂， 研究 清除自由基的机理有一定的应用价值。徐向荣等 ［３１］ 用二甲亚砜捕获 ＯＨ·生成的甲基亚磺酸与坚 牢蓝 ＢＢ 盐反应生成偶氮砜， 于 ４２０ｎｍ 比色测定 其含量间接测定 ＯＨ·， 该法还测定了核桃、黑芝
摘要： 本文对氧自由基的分析测定方法进行了综述和评价， 主要包括电子自旋共振、高效液 相色谱法、分光光度法、化学发光法、荧光和电化学等方法。 关键词： 羟基自由基； 超氧阴离子自由基； 综述 中图分类号： Ｏ６５ 文献标识码： Ａ 文章编号： ＣＮ１１－ ５３４０ ／Ｎ（２００７）０１－ ０００３－ ０５
＊ 收稿日期： ２００７－ ０１－ １８ ＊＊ 作者简介： 王炳娟（ １９８３－ ） ， 女， 山西晋城市人， 首都师范大学化学系研究生。
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北京教育学院学报（ 自然科学版）
剂， 如二甲亚砜、苯丙氨酸、水杨酸等。Ｆｕｋｕｉ 等［７］ 用 ＤＭＳＯ 捕获 ＯＨ·生成甲基亚磺酸， 再同坚牢 黄 ＧＣ 盐反应生成 ２－ 氯苯重氮甲砜。用乙酸乙 酯萃取后， Ｃａｐｃｅｌｌ－ ＰａＫ ＮＨ２ 柱， 乙醇－ 正己烷（ ３： １００） 作流动相分离， ２８５ｎｍ 检测。检测限为 ８ｎｇ／ ｍＬ， 在牛肝匀浆中的加标回收率大于 ７０％。该法 适用于 Ｆｅｎｔｏｎ 反 应 和 次 黄 嘌 呤－ 黄 嘌 呤 氧 化 酶 系统中产生的 ＯＨ·的测定。Ｔａｉ 等［８］用 ＤＭＳＯ 捕 获 ＯＨ·生成甲醛， 再同 ２， ４－ 二硝基苯肼（ ＤＮＰＨ） 反应生成相应的腙 （ ＨＣＨＯ－ ＤＮＰＨ） 。ＸＤＢ－ Ｃ１８ 柱， 甲醇－ 水（ ６０：４０） 作流动相（ 流速 １ｍＬ／ｍｉｎ） 分 离， 检测限为 ０．５４μｍｏｌ／Ｌ。该法已用于深度氧化 过程中 ＯＨ·的测定。Ｊａｈｎｋｅ 等［９］利用 ＤＭＳＯ 捕捉 ＯＨ·生成甲基亚磺酸， 其测定采取 ＨＰＬＣ 分离电 化学检测。该方法测定甲基亚磺酸的检测限为 ２ｎｍｏｌ／Ｌ。与传统的生色法相比， 该法简单， 灵敏 度高。Ｋａｕｒ 等［１０］用苯丙氨酸捕获 ＯＨ·生成酪氨 酸， Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ Ｃ－ １８ 柱， 含 １０％甲醇的 ０．０５ｍｏｌ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４ （ Ｈ３ＰＯ４ 缓 冲 液 （ ｐＨ３．０） 作 流 动 相 分 离 ， ２７４ｎｍ 检测。邻、间、对位的酪氨酸和苯丙氨酸及 它的代谢产物得到很好的分离。该方法已用于早 产儿血液中 ＯＨ·的测定。Ｄａｓ 等［１１］为了测定在心 肌局部缺血再灌注时可能产生的羟基自由基， 采 用 Ｌａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ 技术灌注离体的老鼠的心脏。将 水杨酸加入到灌注通路中， 用来捕捉 ＯＨ·形成 ２， ５－ 和 ２， ３－ 二 羟 基 苯 甲 酸 。 Ａｌｔｅｘ Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ ＯＤＳ 柱， 含醋酸钠和柠檬酸的缓冲液作流动相， Ｍｏｄｅｌ ４６０ 电化学检测器， Ａｇ／ＡｇＣｌ 作参比电极， 在 ０．６Ｖ 检测。这些结果也为心脏中 ＯＨ·的存在 提供了证据。
第 ２ 卷第 １ 期 ２００７ 年 ２ 月
北京教育学院学报（ 自然科学版） ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＥＩＪＩＮＧ ＩＮＳＴＴＴＵＴＥ ＯＦ ＥＤＵＣＡＴＩＯＮ（ ＮＡＴＵＲＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥ）
Ｖｏｌ．２ Ｎｏ．１ Ｆｅｂ．２００７
氧自由基的分析研究进展 ＊
王炳娟 ＊＊
（ 首都师范大学化学系 北京， １ ０００３７）
源自文库
在生命活动的氧化代谢过程中会不断地产 生 各 种 自 由 基 ， 其 中 超 氧 阴 离 子 自 由 基 （ Ｏ２－·） ﹑ 羟基自由基（ ＯＨ·） 和脂自由基（ ＲＯＯ·） 是三种具 有代表性的自由基， Ｏ２－·形成最早， 而 ＯＨ·作用 最强。ＯＨ·是一个氧化能力很强的自由基， 可以 发生电子转移， 夺取氧原子和羟基化等反应， 能 使糖类，氨基酸， 蛋白质， 核酸和脂类等发生氧 化， 遭受损伤与破坏， ＯＨ·与衰老， 肿瘤， 辐射损 伤和细胞吞噬作用有关［１，２］。Ｏ２－·不仅自身具有毒 性， 而且可以经过一系列反应生成其它氧自由 基， 进一步对生物体产生损伤作用。因此，近年来 在基础医学， 临床医学， 预防医学， 药学等领域， 对氧自由基开展了广泛的研究工作。由于氧自由 基的反应活性大， 寿命短， 存在浓度低， 因此在有 关涉及氧自由基的研究中， 其测定方法就显得特 别重要。本文对有关 ＯＨ·及 Ｏ２－·的分析测试方 法进行综述和评价。
除此以外， 还有以酚类［１２］、α－ 松萜［１３，］、苯甲酸 ［１４］等作 ＯＨ·的捕获剂， 用 ＨＰＬＣ 对其羟基化产物 进行分离检测， 也都取得了较为满意的结果。
三、气相色谱法 ＯＨ·与 甲 硫 基 丙 醛 反 应 产 生 乙 烯 ， 或 与 ＤＭＳＯ 反应产生甲烷， 因此可以将甲硫基丙醛或 ＤＭＳＯ 加入到一定的反应体系， 应用气相色谱法 检测所生成的乙烯或甲烷， 判断该反应体系有无 ＯＨ·生成以及测定 ＯＨ·的相对含量。但是， 甲硫 基丙醛也能与其它自由基如 Ｏ２－·反应产生乙烯， ＤＭＳＯ 与 ＯＨ·作用生成的甲烷量也很低， 因此， 许多学者注意到气相色谱法测定 ＯＨ·的专一性 问题。Ｂｅｒｇｈ 等［１５］应 用 α－ 蒎 烯 作 为 ＯＨ·的 捕 获 剂， 用气相色谱法测定氧化产物， 从而间接测定
一、电子自旋共振法 电 子 自 旋 共 振 （ ＥＳＲ） 主 要 的 研 究 对 象 为 具 有未成对电子的自由基和过渡金属离子及其化 合物。自旋捕集（ ｓｐｉｎ ｔｒａｐｐｉｎｇ） 技术的建立为短 寿命自由基的 ＥＳＲ 检测技术开辟了新的途径［３］。 此方法利用自旋捕集剂和短寿命自由基之间的 结合反应， 生成相对稳定的自由基 （ 自旋加合 物） ， 然后进行 ＥＳＲ 测定。由于自旋加合物的寿 命很短， 因此必须在捕集之后立即进行 ＥＳＲ 测 定， 从而限制了许多实验研究。丛建波等［４］采用
二、高效液相色谱法 高效液相色谱法（ ＨＰＬＣ） 测定羟基 自 由 基 ， 在分离检测前需先用捕捉剂捕集自由基， 因此捕 捉剂不但要能捕获所需测定的自由基， 反应产物 具有一定的稳定性， 还要有利于 ＨＰＬＣ 的分离和 检测。用荧光检测， 其灵敏度比紫外可见光检测 要高得多， 但要求捕获自由基后的生成物具有荧 光性质。多种物质均可作为羟基自由基的捕获
王 炳 娟：氧 自 由 基 的 分 析 研 究 进 展
该法研究了一些氨基酸和类黄酮物质清除羟基 自由基的能力。辛淑敏等［２４］根据无荧光的对苯二 甲酸与 ＯＨ·反 应 形 成 强 荧 光 的 羟－ 对 苯 二 甲 酸 加 成 物 ， ３１５ｎｍ 激 发 ， ４２５ｎｍ 检 测 经 物 理 因 素 （ ＵＶ 照 射 ） 及 化 学 因 素 （ Ｆｅｎｔｏｎ 反 应 ） 处 理 后 水 溶液中产生的羟基自由基， 并探讨了血卟啉衍生 物 （ ＨＰＤ） 的 光 敏 作 用 机 理 。 方 光 荣 等［２５］研 究 了 ＯＨ·与 Ｃｅ３＋的 反 应 ， 表 明 在 酸 性 条 件 下 ， 有 强 荧 光的 Ｃｅ３＋被氧化生成无荧光的 Ｃｅ４＋ 。采用流动荧 光注射法测定反应前后荧光强度的下降可间接 测定羟基自由基的量。该方法可作为在线筛选抗 氧化剂以及在线测定羟基自由基的方法。唐波等 ［２６］ 合成了用于 Ｏ２－·识别的新型荧光探针试剂 ２－ 吡啶甲醛苯并噻唑啉， 该探针试剂只能被 Ｏ２－·氧 化， 而共存的双氧水和羟基自由基都不能使其在 测定波长下的荧光发生变化， 所以探针试剂对 Ｏ２－·具有专一性， 由此建立了流动注射 （ 荧光法 测定 Ｏ２－·的方法。此方法可实现 Ｏ２－·和 ＳＯＤ 活 性的实时、在线分析检测。之后他们又合成了新 的荧光探针试剂香 草 醛 缩－ ８－ 氨 基 喹 啉［２７］， 建 立 了新的测定 Ｏ２－·的荧光光度法， 并用于一串红植 物衰老过程中 Ｏ２－·产生速率的测定。
五、荧光分析法 Ｔａｎｇ 等［２２］用流动 注 射 荧 光 法 检 测 对 苯 二 酸 钠－ Ｃｏ２＋－ Ｈ２Ｏ２ 体系产生的 ＯＨ· ， 测定羟基化产 物 ２－ 羟基对苯二酸钠在 ４３１ｎｍ 处的荧光峰值即 可测定体系产生 ＯＨ·的相对量。相对标准偏差 为 ０．５７％。此方法已被用于检测天然食物和玉米 花粉聚糖的抗氧化能力。Ｔａｉ 等［２３］用 ＤＭＳＯ 捕获 ＯＨ·生成甲醛， 再与氨和 １， ３－ 环己二酮反应。产 物发出特征性荧光（ Ｅｘ／Ｅｍ＝４００．４／４５２．３） 。已利用