板蓝根_南板蓝根及大青叶中蛋白质组分分析

中药材 Journal of Chinese M edicinal M aterials 第 31卷第 3期 2008年 3月
lonicerae through a simultaneous determ ination of seven saponins by HPLC with ELSD1 J Chromatogr A , 2005, 1070 (122) : 432481 [ 4 ] L i XP, Yu J, Luo JY, et al1 Simultaneous determ ination of chlorogenic acid, caffeic acid, ferulic acid, p rotocatechuic acid and p rotocatechuic aldehyde in Chinese herbal p repa2 ration by RP2HPLC1 Chem Pharm Bull, 2004, 52 ( 10 ) : 1251212541 [ 5 ] L i HJ, L i P, Ye WC, et al1 Determ ination of five major iridoid glucosides in Flos Lonicerae by high2performance liquid chromatography coup led w ith evaporative light scat2 tering detection1 J Chromatogr A , 2003, 1008 ( 2 ) : 1672 1721 [ 6 ] 黄雄 ,李松林 ,李萍 ,等 1HPLC法同时测定金银花中 8 种黄酮的含量 1药学学报 , 2005, 40 (3) : 28522881 [ 7 ] 黄璐琦 ,王永炎 1中药材质量标准研究 1北京 :人民卫 生出版社 , 2006: 4111
(2007 - 09 - 18收稿 )
板蓝根 、南板蓝根及大青叶中蛋白质组分分析
项雷文 1, 2 ,高观祯 1 ,汪惠勤 1 ,陆华珍 1 ,饶平凡 1 ,周建武 1 (11福州大学生物工程研究所 ,福建福州 350002; 21福建师范大学福清分校 ,福建福清 350300)
摘要 目的 :对抗病毒中药板蓝根 、南板蓝根及大青叶的蛋白质成分进行分析 ;方法 :利用凯氏定氮法对板蓝 根 、南板蓝根和大青叶的生药和相应的新鲜植物组织中的总蛋白含量进行测定 ,利用 Low ry法 , B radford法对提取 液进行蛋白质含量测定 ,提取液中的蛋白质组分应用 SDS2PAGE电泳进行分析 。结果 :三种药材的蛋白质种类和 含量有一定差别 ,且同种药材的新鲜植物组织和生药蛋白质组分在含量和种类上有明显差别 。结论 :板蓝根 、南板 蓝根及大青叶的蛋白质组分差别明显 。这三种中药的新鲜植物组织和生药蛋白质组分上的差异可能是由美拉德 反应造成的 。
本是由其结构中共有的咖啡酰基产生的 ,紫外光谱 特征几乎一致〔7〕,所以可以绿原酸做对照 ,用分光 光度法测定忍冬叶中咖啡酰奎宁酸类的总含量 。
312 本文用高效液相色谱法和分光光度法分别测 定了 5种 1变种共 10 个忍冬叶样品中绿原酸和咖 啡酰奎宁酸类的总含量 ,结果绿原酸在 01193% ～ 01837%之 间 , 其 中 峨 眉 忍 冬 叶 中 含 量 最 高 , 为 01701% ～ 01837% , 其 次 是 忍 冬 叶 ( 01597% ～ 01751% )和红腺忍冬叶 ( 01628% ) ,细毡毛忍冬 、灰 毡毛忍冬和淡红忍冬叶片中含量较低 ,为 01193% ～01312% ; 咖啡酰奎宁酸类的总含量在 111% ～ 617% ,其中峨眉忍冬叶中含量最高 , 为 5199% ～ 6169% ,其次是忍冬叶 ( 4120% ～5111% )和红腺忍 冬叶 (4159% ) ,灰毡毛忍冬叶 2158% ,细毡毛忍冬 叶和淡红忍冬叶中含量最低 ,不到 2%。总的来说 咖啡酰奎宁酸类总含量远比绿原酸的含量高 ,前者 大约是后者的 5～8倍 。
·390·
中药材 Journal of Chinese M edicinal M aterials 第 31卷第 3期 2008年 3月
3 小结与讨论 311 供试品溶液和对照品绿原酸溶液的紫外扫描 图谱在 250～400 nm 范围内一致 ,而绿原酸 、异绿原 酸 、新绿原酸等咖啡酰奎宁酸类成分中紫外光谱基
南板蓝根鲜根 7176
ND
0109
1124
南板蓝根生药 7148
ND
0126
4165
大青叶鲜叶
24185
ND
0137
5163
大青叶生药
19108
ND
0151
13184
从表 1可以看出 ,新鲜状态的药用植物组织的 总蛋白质含量均比晒干后的药材的总蛋白质含量 高,大青叶鲜叶总蛋白含量比大青叶生药高 30124%。从总蛋白来看 ,大青叶中含量最高 ,生药 总蛋白质含量达 19108% , 其次是板蓝根 、南板蓝 根 。从提取液中可溶性蛋白的含量来看 ,三种测定 方法中测出值最高的是凯氏定氮法 ,其次是 Low ry 法 , B radford法最低 。 312 板 蓝 根 、南 板 蓝 根 、大 青 叶 提 取 液 的 SDS2 PAGE结果 板蓝根 、南板蓝根 、大青叶提取液的 SDS2PAGE结果如图 1所示 。以标准蛋白的迁移率 Rf 为横坐标 ,以标准蛋白相对分子质量的对数为纵 坐标 ,绘制标准曲线 ,计算得回归方程为 log MW = 419836 - 111708 Rf ,相关系数 r = 019728,以此计算 出板蓝根 、南板蓝根 、大青叶提取液中含有的蛋白质 成分的相对分子质量 。
不同方法检测药材的蛋白质含量 ,结果不一致 , 这跟三种方法测蛋白质的原理以及提取时成分溶出 率有关 ,凯氏定氮法测提取液中总含氮量 ,部分含氮 的非蛋白质物质会导致蛋白浓度的计算结果偏高 ; 样品提取液中一些酚类物质对 Low ry法测定有干 扰 ,并且酚类物质更容易溶出 ,因此结果有所偏高 ;
·392·
从图 1可以看出 ,蛋白浓度最高的是板蓝根 ,其 次是大青叶 、南板蓝根 ,这与 B radford法测定蛋白质 浓度相符合 ,南板蓝根中几乎看不出蛋白质条带 ,只 有非常浅的条带 ,说明其提取液中可溶性蛋白很少 。 三种药材的蛋白质分布不同 ,板蓝根 2012 kDa、2213 kDa的主要条带在大青叶与南板蓝根中都没有 ;加 工前后的药材相比 ,加工后药材电泳条带呈糊化状 , 而新鲜的药材条带清晰 ;板蓝根生药与板蓝根鲜根 相比 ,不含有 3711 kDa的电泳条带 。板蓝根生药的 SDS2PAGE用 PAS染色 ,在 2012 kD、2213 kDa处有 明显条带 。在图 1的顶部 ,即大于 94 kDa电泳条带 处 ,生药的条带都比新鲜植物组织的深 。 4 讨论
质含量 ,结果如表 1。
表 1 板蓝根 、南板蓝根 、大青叶中蛋白质含量
总蛋白
提取液中蛋白质含量 (mg /mL )
质含量
wenku.baidu.com
( % , w /w) 凯氏定氮法 B radford法 Lowry法
北板蓝根鲜根 13159
9107
0194
3122
北板蓝根生药 11138 22116
0192
10174
中药材 Journal of Chinese M edicinal M aterials 第 31卷第 3期 2008年 3月
·391·
蛋白含量 ,利用 SDS2PAGE电泳检测板蓝根 、南板蓝 根及大青叶提取液中的蛋白质组成和分布情况 。 1 材料 111 样品 板蓝根 :鲜根采自安徽省阜阳市太和 县阮桥镇北板蓝药材 GAP种植基地 ;生药从福州中 药批发市场购买 ,产地安徽省阜阳市亳州 ; 南板蓝 根 :鲜根及生药均采自福建省仙游县书峰乡南板蓝 根 GAP种植基地 ;大青叶 :鲜叶及生药均采自安徽 省阜阳市太和县阮桥镇北板蓝根药材 GAP种植基 地 。以上药材均由福建中医学院杨成梓教授鉴定 。
112 试剂 所用试剂均为分析纯 ,所有溶液均用 高纯水配制 。提取缓冲液 :含 011 mol NaC l的 0102 mol/L pH 712磷酸缓冲液 ( PB S) 。 113 仪器 J2251型高速离心机 ,美国 Beckman公 司 : HHS恒温水浴锅 ,厦门医疗仪器厂 ; 凯氏定氮 仪 ,福州玻化有限公司 ; 752 型紫外可见分光光度 计 ,上海光谱仪器有限公司 ; FW 100型高速万能粉 碎机 ,天津泰斯特公司 。 2 方法 211 样品提取液的制备 称取 100 g样品 ,置于液 氮中冷却 ,然后在高速万能粉碎机中粉碎 。在样品 粉末中加入 300 m l提取缓冲液 , 4℃搅拌 12 h。而 后在 4℃下 , 12000 r/m in离心 20 m in,上清液即为样 品提取液 。 212 凯氏定氮法 [ 2 ] 蛋白质系数取 6125。 213 Fo lin2酚试剂 (Low ry法 ) [ 2 ] 以 650 nm 处吸 光值为横坐标 ,牛血清白蛋白标准溶液浓度为纵坐 标 ,绘制标准曲线 ,计算得回归方程为 : Y = 420199 A - 7168, r = 019943。样品测定时取提取液 1100 m l。然后测定吸光度 ,由回归方程计算得相应浓度 。 214 考马斯亮蓝法 (B radfo rd) [ 2 ] 以 595 nm 处吸 光值为横坐标 ,牛血清白蛋白标准溶液浓度为纵坐 标 ,绘制标准曲线 ,计算得回归方程为 : Y = 1159160 A 2411544, r = 019933。样品的测定时取提取液 1100 m l。然后测定吸光度 ,由回归方程计算得相应浓度 。 215 SDS2PAGE蛋白质凝胶电泳 [ 2 ] 取样品提取 液与等体积的 SDS2PAGE处理液混匀 ,煮沸 10 m in。 1215%浓度的 SDS2PAGE,电压 120 V。然后对 SDS2 PAGE 分 别 进 行 考 马 斯 亮 蓝 显 色 和 过 碘 酸 2希 夫 ( PAS)显色 [ 3 ] 。 3 结果 311 板蓝根 、南板蓝根 、大青叶中蛋白质含量测定 结果 利用凯氏定氮法测定北板蓝根鲜根与生药的 总粗蛋 白 质 含 量 , 分 别 用 凯 氏 定 氮 法 、Low ry 法 、 B radford法测定北板蓝根鲜根与生药提取液的蛋白
参考文献 [ 1 ] 明 ·卢之颐 1本草乘雅半偈 1校点本 1北京 :人民卫生
出版社 , 1986: 44424451 [ 2 ] 明 ·李时珍 1本草纲目 1校点本 1第 2册 1北京 :人民
卫生出版社 , 1977: 1334213351 [ 3 ] Chai XY, L i SL , L i P, et al1 Quality evaluation of Flos
关键词 板蓝根 ;南板蓝根 ;大青叶 ;蛋白质 ;美拉德反应 中图分类号 : R28411 文献标识码 : A 文章编号 : 100124454 (2008) 0320390203
板蓝根为十字花科植物菘蓝 ( Isa tis ind igotioca Fort1)的干燥根 ,味苦 ,性寒 ,有清热解毒 、凉血利咽 功效 。南板蓝根为爵床科植物马蓝 (B aph icacan thus cusia (Nees) B remek)的干燥根茎及根 ,味苦 ,性寒 , 有清热解毒 、凉血功效 。大青叶为十字花科植物菘
蓝的干燥叶 ,味苦 ,性寒 ,具有清热解毒 、凉血消斑功 效 [ 1 ] 。这三种药材在中医临床上常用于治疗病毒 性疾病 ,尤其在抗流感病毒方面疗效确切 。本文通 过凯氏定氮法 , Folin2酚试剂 (Low ry)法 ,考马斯亮蓝 (B radford)法测定板蓝根 、南板蓝根及大青叶中的
作者简介 :项雷文 (19752) ,男 ,浙江淳安人 ,讲师 ,硕士 ; Tel: 13960738979, E2mail: xiangleiwen@1631com。