蛋白质表达

• T7RNA聚合酶基因插入由大肠杆菌lacUV5启动子 控制、λDE3溶原状态下的大肠杆菌染色体上。
• 在pET表达载体的T7启动子的下游有一个lac操纵 子序列，这个载体还有一个带有常规启动子以及
编码lac阻遏蛋白的序列（lac I）。T7启动子、lac 操纵子和lacI位置交错。
• pET表达载体在λDE3溶原状态下的大肠杆菌中， lac阻遏蛋白可以作用于大肠杆菌染色体上，抑 制宿主菌转录T7RNA聚合酶，也作用于T7启动 子下游的lac操纵子，以阻断任何T7RNA聚合酶 导致的目的基因转录。(保证表达质粒在宿主菌 中的稳定)
哺乳动物细胞表达系统的表达载体
酵母菌表达系统
酵母菌表达外源基因的优势： • 全基因组已测序，表达调控机理比较清楚，遗传操作简
便 • 具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统 • 能将外源基因表达产物分泌至培养基中（分泌型） • 不含有特异性的病毒、不产生内毒素，ＦＤＡ认定为安
全的基因工程受体系统（Generally recognized as Safe
真核生物表达系统
• 昆虫细胞表达系统 • 哺乳动物细胞表达系统 • 酵母菌表达系统
昆虫细胞表达系统
• 昆虫表达系统是利用培养的昆虫细胞或幼虫，通过 杆状病毒载体来表达哺乳动物细胞蛋白
• 允许插入较大的外源基因 • 可以胞内表达，也可以进行分泌性表达 • 能进行蛋白质翻译后加工:糖基化、磷酸化等等 • 杆状病毒具有宿主专一性，对其他动物是安全的 • 缺点：每表达一次蛋白都要制备新的病毒，蛋白质
菌利用葡萄糖分解供给能量时，cAMP生成 少，cAMP含量低；相反，当环境中无葡萄 糖可供利用时，cAMP含量就升高，cAMP 与cAMP的受体蛋白 CRP （cAMP receptor protein）结合变为CAP，并以二聚体的方 式与特定的DNA序列结合。
在缺乏葡萄糖的培养基中时，CAP合成量增加，CAP具 有激活乳糖（Lac）等启动子的功能。一些依赖于 CRP的启动子缺乏一般启动子所具有的典型的序列特 征。因此RNA聚合酶难以与其结合。CAP能提高RNA 聚合酶与启动子结合常数：
• 表达产物不稳定，易被细菌蛋白酶降解 • 细菌的内毒素（热源）不易除去，会造成人畜发热
大肠杆菌表达体系的转录调控
大肠杆菌的基因多数以操纵元的形式组成基因表达
调控的单元，操纵元包括相关结构基因及其上游的
调控序列。
乳糖操纵元（lac operon）：
I
CAP P O
调控序列
z
y
a
结构基因
P：启动子 O：操纵子 I：调节基因
GRAS) • 大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉 • 酵母菌是最简单的真核模式生物
如果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达 系统，酵母菌则是最成熟的真核生物表达系统。
酵母菌表达系统的宿主菌
• 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） • 乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis） • 多形汉逊酵母（Hansenula polymorpha） • 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）
的加工与哺乳动物还是有区别。
昆虫杆状病毒（baculovirus）
一种广泛应用的杆状病毒是多核型多角体病毒 （AcMNPV），病毒在其侵染周期中，产生两种 形式的病毒：单个病毒颗粒，该颗粒从受感染的 细胞中释放出来后又去感染其他的细胞；多角体， 多个病毒颗粒被包裹在蛋白外壳（多角体蛋白） 中，当细胞裂解或宿主死亡后，多角体就释放到 环境中。
遗传密码与tRNA
除了极个别情况,遗 传密码在所有的有 机体内是相同的,但 是不同的有机体内 不同密码子的使用 程度不同。而这种 不同是由于tRNA在 不同的机体内的丰 度不同。
大肠杆菌
人
蛋白质前体的加工
• N端fMet或Met的切除 • 二硫键的形成 • 特定氨基酸的修饰 • 切除新生肽链中非功能片段 • 多聚体构成的蛋白质还要经过聚合过程 • 糖基化，磷酸化等等
• 异丙基硫代半乳糖苷（isopropylthiog-alactoside IPTG），一种化学合成的乳糖类似物，能与阻遏 蛋白特异性结合使阻遏蛋白R构象变化，诱导lac操 纵元的开放，但本身不受β-半乳糖苷酶的催化分解 而十分稳定。
CAP(cAMP activated protein)的正调控 • cAMP含量与葡萄糖的分解代谢有关，当细
菌和相应的载体可供选择应用 • 易于进行遗传操作和高效表达 • 操作安全，致病能力低 • 生长迅速，培养代谢易于控制，成本相对低等等
大肠杆菌表达体系的缺点
• 缺乏真核生物的转录后和翻译后加工机制，不宜表达 真核生物的蛋白
• 缺乏表达蛋白复性系统，表达蛋白无特异性空间结构, 常形成不溶性包涵体 (inclusion body)
• pET表达载体的功能非 常强大，即使pET表达 载体上的T7启动子只是 造成低水平的本底表达， 通常也会造成敏感宿主 菌生长困难以及表达宿 主中质粒不稳定。所以 常用的克隆宿主菌是 NovaBlue，JM109以及 DH5α。
表达宿主菌（ pLysS和pLysE 等）
抗生素抗性
• 如果β-内酰胺酶基因位于T7启动子的下游并与之 同向，虽然载体都带有天然T7转录终止子 （TΦ），但是这个终止子只有大约70%的效率， T7RNA聚合酶仍能读通从而除了产生目的RNA 外也有少量的β-内酰胺酶RNA，这样，诱导的培 养体系中就会有β-内酰胺酶， 会使氨苄青霉素降 解，从而使筛选失败。
蛋 白 的 糖 基 化
蛋白质的分泌
不论原核生物还是真核生物，在细胞内合成的蛋 白质需定位于细胞内的特异区域，或者分泌出 细胞。分泌性蛋白都有一段信号肽，即在蛋白 质合成过程中N端有一15~36个氨基酸残基的 肽段－－信号肽，它能引导蛋白质的肽链到达 并通过内质网，然后被内质网中的信号肽酶切 除。相对于真核生物来说，原核生物蛋白的分 泌要简单得多。
调节型强启动子
在克隆基因上游设置调节型强启动子是一个高效的蛋白质 表达系统最基本的条件:
• 不同启动子，效率不同。强启动子可产生较多mRNA。
• 强启动子使外源基因的大量持续表达往往对宿主细胞有 害，因为这一过程会消耗大量能量，从而破坏宿主细胞 的必要的生理功能。
• 带有表达目的基因的质粒，在几次细胞分裂后会丢失。 • 解决的办法：引入强启动子并控制目的基因在宿主细胞
• CAP通过改变启动子的构象以及与酶的相互作用帮助 酶分子正确定向,以便DNA结合。
• CAP还能抑制RNA聚合酶与DNA中其它位点的结合， 从而提高与其特定启动子结合的概率。
由于P1ac是弱启动子，单纯因乳糖的存在发生去阻 遏使1ac操纵元转录开放，还不能使细胞很好利 用乳糖，必须同时有CAP来加强转录活性，细菌 才能合成足够的酶来利用乳糖。1ac操纵元的强 诱导既需要有乳糖的存在，又需要没有葡萄糖可 供利用，通过CAP的正调控作用，细菌才能充分 利用乳糖。
距翻译起始密码AUG上游约3-11个 bp（-3— -11bp）。 SD序列与16s rRNA3’末端碱基AUUCCUCC互补，控 制翻译的起始。二者互补的程度以及SD序列与起始密 码间的合适距离(一般是8个bp）都影响mRNA的翻译 效果。
mRNA5`-------UAAGGAGGU-----AUG 16S rRNA3` -------AUUCCUCCA-------
z：β-半乳糖苷酶 y：通透酶 a：转乙酰基酶
乳糖(lac)操纵元的表达调控是利用阻遏蛋白的负 性调控而实现的： • 大肠杆菌在没有乳糖的环境中生存时，1ac操纵元处于 阻遏状态。i基因在自身的启动子pi控制下，产生阻遏蛋 白R。R以四聚体形式与操纵子o结合，阻碍RNA聚合酶 与启动子P的结合，阻止基因的转录起始。 • R的阻遏作用不是绝对的，R与O偶尔解离，使细胞中 还有极低水平的β-半乳糖苷酶及通透酶的生成（本底表 达）。
由于P1ac是弱启动子，实际上的基因工程 应用中，通过1ac启动子-10区核苷酸突变 产生的1acUV5启动子经常用于质粒表达 载体中，这种启动子比野生型1ac启动子 更强。
• pET表达载体的启动子是T7噬菌体基因10启动子 （T7启动子），需要T7RNA聚合酶才能转录。
• T7RNA聚合酶转录机制十分有效并具有选择性：充 分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋 白；在非诱导条件下，几乎可以使目的基因完全处 于沉默而不转录。
标签 • 一个转录终止信号 • 一个分泌信号肽（分泌型）
融合蛋白
融合蛋白是两个或多个基因的部分编码区连 接起来而编码的氨基酸序列。融合蛋白的作用： • 提高外源蛋白在表达系统中的稳定性 • 增加外源蛋白在表达系统中的表达量 • 增加目的蛋白的溶解性 • 作为抗原的标记蛋白 • 易于外源蛋白的纯化
林政
• mRNA的生物合成 • 蛋白质生物合成 • 原核生物表达系统 • 真核生物表达系统 • 蛋白质的纯化方法
mRNA的生物合成 (转录)
• 目的基因 • RNA聚合酶 • 启动子 • 转录终止信号 • 转录因子等等
启动子
• 启动子是DNA分子可以与RNA聚合酶特异 结合的部位。 某个基因是否表达决定于特 定的启动子的起始转录。
单颗粒病毒粒子
多角体
哺乳动物细胞表达系统
• 哺乳动物细胞表达系统最大的优点是能表达翻译 后修饰过的外源蛋白
• 哺乳动物细胞表达系统的缺点是，对组织细胞培 养技术要求高，培养和筛选细胞株的周期长
• 常用的细胞系有：非洲绿猴肾细胞（COS）、小 仓鼠肾细胞（BHK）、人的胚胎肾细胞（HEK239）、中国仓鼠卵巢细胞（CHO）
大肠杆菌mRNAs的SD顺序与16SrRNA的3`-端的互补性
AUG前后的核酸序列
真核生物无SD序列，但是有一个Kozak序列， 这个序列影响真核mRNA的起始翻译。这个序列 -3位的A最重要，而且在+4位最好是嘌呤，G是 最优的碱基。
-6 -5 -4 -3 -2 -1 1 2 3 4 G C C AC C AUGG
T7 lac 启 动 子 的 调 控
• 另一个为目的基因提供稳 定性保证的方法是在拥有 兼容的氯霉素抗性、编码 表达少量T7溶菌酶的宿主 菌（pLysS和pLysE）中 表达。 T7溶菌酶是一种 双功能蛋白：它能够切割 大肠杆菌细胞壁肽聚糖层， 也可与T7RNA聚合酶结 合，阻止转录。
pLysS 和 pLysE
宿主染色体DNA整合
• 如果将目的DNA直接引入宿主生物的染色体中， 就能克服质粒丢失的问题。目的基因整合到宿 主染色体时，染色体整合位置必须在所需的编 码以外，即，DNA序列必须插入到染色体中特 定的非必要位点，两个DNA分子之间只要发生 同源重组即可。为了将DNA整合到染色体中， 插入DNA一般至少需要与染色体DNA有50个核 苷酸相同的序列。
融合蛋白作为抗原的标记蛋白
C-myc 标记蛋白 V5 标记蛋白
融合蛋白易于外源蛋白的纯化
Amylose树脂
MBP麦芽糖结合蛋白
目的蛋白
10 mM 麦芽糖
MBP
Factor Xa 蛋白酶切割位点
非融合蛋白的纯化
融合蛋白的纯化
原核生物表达系统
原核生物表达系统:大肠杆菌、枯草杆菌、农杆菌 大肠杆菌表达体系的优点： • 积累了相对充分的研究工作，有多种表型的宿主
生长周期的某一特定时期发生转录，并且持续特定的时 间。
蛋白质的生物合成（翻译）
• mRNA起始翻译受下列因素影响 mRNA的核糖体结合位点 AUG前后的核酸序列
• 遗传密码与tRNA • 蛋白质前体的加工 • 蛋白质的分泌
mRNA的核糖体结合位点
SD序列(Shine-Dalgarno）UAAGGAGGU SD序列位于mRNA 5`末端非翻译的前导区内，其起点
一些信号肽的一级结构
蛋 白 的 分 泌 （ 一 ）
蛋白的分泌（二）
革 兰 氏 阳 性 菌 蛋 白 的 分 泌
革 兰 氏 阴 性 菌 蛋 白 的 分 泌
表达来自百度文库体
理想的表达载体质粒包括： • 一个具有3种不同的阅读框以方便基因插入的多克隆位
点 • 一个调节型的强启动子 • 一个选择性标记 • 一个复制起点 • 一个有助于蛋白质的稳定、纯化并可去除的融合蛋白