结晶紫脱色菌的筛选及脱色特性研究

结晶紫脱色菌的筛选及脱色特性研究

前言：我校求索溪的水体为污水。污染它的原因是多方面的，当然这不在此次实验的研究范围内，所以就不涉及了。我国是联合国认定的“水资源最为紧缺”的13个国家之一，人口的增长，工业化、城市化以及灌溉对水的需求量日益增加，再加上水资源本身分布不均、水污染、水生态系统失衡等问题加剧了当前水资源供需矛盾，使我国水资源危机越发凸显，进而成为我国经济发展的严重制约因素之一。造成水体有色的主要因素是染料，根据环境污染治理专家研究发现，治理染料污染最有效的方法是生物法，生物法除了效果明显，也是对环境危害最小，是一种环境友好的除污方法。

本实验即是从生物防治染料污水的角度出发，从求索溪的污水中提取脱色细菌，并对其进行一系列实验，包括染料脱色菌的富集、分离、染料脱色菌的驯化培养、染料脱色菌脱色能力的测定和染料脱色菌生长曲线的测定。

1.实验材料与方法:

1.1菌种来源：求索溪污水

1.1.2染料：结晶紫，最大吸收波长为587 nm

1.1.3培养基：

富集培养基：KH2PO41g，(NH4)2SO41g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，牛肉膏1g，水1000ml，pH值为7.0，121℃下灭菌20min. 基础培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g, NaCl 5g, 水1000ml，pH 值为7.0, 121℃下灭菌20min.

脱色培养基：基础培养基中分别加入一定量的染料。其中，次甲基蓝的质量浓度是20 mg/L。

1.1.4实验仪器：电热恒温培养箱、光照培养箱、台式高速离心机、752型紫外可见分光光度计、台式压力蒸气灭菌锅、冰箱、电子天平、恒温振荡器

1.2实验方法：

1.2.1染料脱色菌的筛选和纯化

染料脱色菌的富集：从自选污水中取10g的污水，用无菌纱布过滤后，接入含150ml富集培养基的锥形瓶中，然后放入摇床中，在37℃振荡条件培养2天后观察现象，取出颜色有明显变化的锥形瓶，进行下一步的实验。

菌种的分离筛选及纯化：在无菌条件下，用移液管从培养的锥形瓶中吸取0.2ml的菌液，，将其移至加有次甲基蓝的脱色培养基培养皿上，在37℃恒温培养箱中培养一天后，待菌落长出后，拍照。以脱色圈大小、菌落大小作为指标，初步筛选出有效菌株，选取长势好、菌落下培养基脱色圈明显的菌落，用接种环在无菌条件下挑取菌落接种至倒好的斜面培养基上，放入37℃恒温培养箱中培养，进行纯化。

筛选得到的纯化菌种放于实验室菌种保藏箱内存放。

1.2.2 染料脱色菌生长曲线的测定

采用比浊法测定菌株的生长曲线，由于细菌悬液的浓度与光密度（OD 值）成正比，因此可利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓度，并将所测的OD值与其对应的培养时间作图，即可绘出菌株在30℃液体培养下的生长曲线。测定菌株的生长曲线具体步骤如下：(1)种子液制备

取斜面菌种各1支，以无菌操作挑取1环菌苔，接入无菌牛肉膏蛋白胨培养液中，30℃震荡培养18h作种子培养液。

(2)标记编号

取盛有10ml无菌牛肉膏蛋白胨培养液的试管，在每支上分别编号为0、2、4、6、8、10、12h。

(3)接种培养

用1ml无菌吸管分别准确吸取0.2ml种子液加入已编号的试管中，于30℃下振荡培养。然后分别按对应时间将试管取出，立即放4℃冰箱中贮存，待培养结束时一同测定OD值。

(4)生长量测定

将未接种的牛肉膏蛋白胨培养基倾倒入比色杯中，选用600nm波长，分光光度计上调节零点，作为空白对照，并对不同时间培养液从0h 起依次进行测定，对浓度大的菌悬液用未接种的无菌牛肉膏蛋白胨液体培养基适当稀释后测定，使其OD值在0.10～0.65以内，经稀释后测得的OD值要乘以稀释倍数，才是培养液实际的OD值。

(5)绘制生长曲线

记录测定的各OD值，以上述时间标志为横坐标，相应的OD（587nm）值为纵坐标，绘制菌种的生长曲线。

1.2.3 染料脱色菌脱色能力的测定

将分离纯化的菌株分别接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃，150r/min振荡培养24h。取新鲜制备的菌悬液5mL，加入到含100ml 脱色培养基的锥形瓶中，然后在37℃，150r/min震荡条件下的摇床中持续培养48小时后取样，将离心机设置为10000prm离心10分钟，取上清液在染料的最大吸收峰处测吸光度值，并以不加菌的脱色培养

基为对照，计算脱色率。以脱色率的大小来表示菌种对染料的脱色能力。

脱色率：（A﹣B）/A×100%式中，

A——不加菌液的吸光度值

B——t时间后的接菌液的吸光度值

2.实验结果

2.1菌落生长状况：菌落成圆形紫色斑点状,数量少,菌落周围颜色变淡，图片如下

2.2染料脱色菌生长曲线的测定：

2.2.1不同时间培养菌液在587nm波长下的OD值表：

2.2.2脱色菌生长曲线图：

2.3染料脱色菌脱色能力的测定:

两种菌液在587nm波长下的OD值:

不加菌液：1.325

加菌液：0.126

根据以上可得：

脱色率=（A﹣B）/A×100%

=（1.325-0.126）/1.325*100%

=90.49%

3.讨论与分析

3.1脱色菌在培养之初一直在增长，说明已经度过了适应期，但不是成对数增长，说明培养基某种条件（如PH值，C/N等）还不是很符合该种菌；从第6h进入稳定期，菌数量达到最大；从第10h进入衰亡期，数量开始减少，这可能是由于营养物质的减少、菌落中个体间的竞争或代谢过程中产生了有害物质。

3.2加入脱色菌使培养基颜色明显变浅，效果比较理想，可以作为治理含与结晶紫类似染料废水的理想菌种。但若要投入实际应用，还要进行进一步的研究，探究出该菌的适应生长、繁殖条件，包括适宜的废水PH值，有机物C/N，温度，理想的COD、BOD值，进入稳定期需要的时间，以及它的生态效应等各种情况，再根据当地水体的具体情况投入实际应用

参考文献