曲张链菌素生产菌壮观链霉菌NRRL 2494遗传操作体系的 …

曲张链菌素产生菌壮观链霉菌NRRL 2494

遗传操作体系的建立

宋姣姣1，康前进2，张连茹1，吴莹莹1*，白林泉2（1.厦门大学生命科学学院，天然产物源靶向药物国家地方联合工程实验室，福建厦门361005；2. 上海交通大学生命科学技术学院，微生物代谢国家重点实

验室，上海200040）

摘要：曲张链菌素属于安莎类抗生素，具有显著的生物活性．在从壮观链霉菌NRRL 2494的发酵产物中分离和鉴定了多组分曲张链菌素的基础上，探索和优化了外源DNA通过接合转移进入壮观链霉菌NRRL 2494的操作方法和培养条件．以游离型质粒pJTU1278为载体，在体外构建了一个曲张链菌素酰胺合酶基因svaF敲除的质粒，通过接合转移转入到壮观链霉菌NRRL 2494野生型菌中，所获得的svaF基因缺失突变株失去了产曲张链菌素的能力．该遗传操作体系的成功建立和优化，使得在体内分析和鉴定曲张链菌素生物合成基因的功能成为可能，同时也为建立其他类似放线菌的遗传操作体系提供了参考．

关键词：壮观链霉菌；遗传操作体系；曲张链菌素；生物合成；酰胺合酶

中图分类号：Q 933 文献标志码：A

放线菌所产生的次级代谢产物是天然活性物质的重要来源．曲张链菌素（streptovaricin）属较早发现的安莎类抗生素，其组分A-E由Siminoff[1]和Ravina等[2]于1957年从壮观链霉菌（Streptomyces spectabilis）NRRL 2494的发酵产物中首先分离，其中streptovaricin A和C 的基本化学结构在1968年得到纯化和鉴定[3]．此后，科学家们还从其他壮观链霉菌株中先后分离和鉴定了组分F, G, K, J, U等数个曲张链菌素的同系物[4-5]，发现这些化合物都有共同的芳香核-萘醌环（图1）．对曲张链菌素的生物合成进行初步研究发现，其以3-氨基-5-羟基苯甲酸（3-amino-5-hydroxybenzoic acid，AHBA）为前体，经I型聚酮合酶（polyketide synthase I, PKS I）催化的10步缩合反应延伸完成聚酮脂肪长链，最终形成大环内酰胺结构并释放[6]，这一聚酮链骨架的化学结构和合成过程与著名的抗结核临床药物利福霉素相同．

基金项目：国家自然科学基金项目（31100027）；高等学校博士学科点专项科研基金项目（20110121120013）．*通信作者：wuyingying@

图1 曲张链菌素的化学结构式

Fig.1 Chemical structures of streptovaricins

由于曲张链菌素具有抑制RNA聚合酶和反转录酶（DNA聚合酶）的活性[7-9]，目前已发现其对结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）和非结核分枝杆菌如堪萨斯分支杆菌（Mycobacterium kansasii）、鸟杆菌（Mycobacterium avium）等都有显著的抗菌活性[10-11]，并有抗病毒活性和优于环孢菌素A的免疫抑制功能[4]，但由于毒性较大而较少使用．随着合成生物学的学科发展和技术创新，通过组合生物合成的策略对目标抗生素进行结构优化成为可能[12-14]。基于曲张链菌素良好的药物开发前景，我们试图发掘生物活性更好的新结构类似物并增加其产量，从而适合工业化开发．成功建立抗生素产生菌的遗传操作体系是对抗生素进行生物合成研究和结构改造的前提，但关于壮观链霉菌的遗传操作体系目前还未见报道．本文以曲张链菌素产生菌壮观链霉菌NRRL 2494菌株为对象，在了解其抗生素敏感性和生长速度快等特点的基础上，发现了缩短常规结合转移时间和使用半营养培养基等方法对结合转移的促进作用，成功实现了对曲张链菌素生物合成基因的敲除突变．该遗传操作体系的建立为进一步研究曲张链菌素的生物合成奠定了基础．

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1菌株和质粒

产生曲张链菌素的壮观链霉菌NRRL 2494，用于结合转移的游离型质粒载体pJTU1278[15]，作为阿泊拉霉素抗性基因来源的质粒pJTU472[16]由上海交通大学微生物代谢国家重点实验室构建并保存；构建克隆用载体pBluescript II SK（+）和宿主菌大肠杆菌（Escherichia coli）Top10，结合转移的质粒供体大肠杆菌ET12567/pUZ8002[17]均由本实验室保存．

1.1.2 培养基

LB培养基（g/L）：胰蛋白胨10，酵母抽提物5，NaCl 10，pH 7.0.

TSBY培养基（g/L）：TSB （Trypticase Soy Broth）30，酵母抽提物10，蔗糖103，pH 7.2.

SFM培养基（g/L）：黄豆饼粉20，加入1 L自来水灭菌后用四层纱布过滤，再加入甘露醇20，pH 7.5.

高氏一号培养基（g/L）：可溶性淀粉20，NaCl 0.5，KNO3 1，FeSO4 0.001，K2HPO4 0.1，MgSO4.7H2O 0.5，pH 7.2. Waksman培养基（g/L）：（NH4）2SO40.2，K2HPO3.3H2O 3.0，MgSO4.7H2O 0.5，CaCl2.7H2O 0.126，pH 7.2．

壮观链霉菌NRRL 2494发酵培养基ZM [4]（g/L）：黄豆饼粉10，葡萄糖25，酵母粉2.5，氯化钾4，K2HPO4 0.1，硫酸铵5，牛肉浸膏1，碳酸钙3．

ISP2和ISP3培养基配方见参考文献[18]．以上对应的固体培养基加入20 g琼脂．

1.1.3 酶和主要试剂

酶类和DNA marker购自TaKaRa公司，DNA回收试剂盒购自OMEGA公司，质粒回收试剂盒购自生工生物工程股份有限公司，其他常规试剂均为国产分析纯级产品，各种抗生素购自国内试剂公司，使用浓度为氨苄青霉素（ampicillin）100 mg/mL，氯霉素（chloramphenicol）25 mg/mL，卡那霉素（kanamycin）25 mg/mL，硫链丝菌素（thiostrepton）10 mg/mL，阿泊拉霉素（apramycin）30 mg/mL，萘啶酮酸（nalidixic acid）25 mg/mL，制霉菌素（nystatin）25 mg/mL．PCR引物由上海英潍捷基贸易有限公司合成，DNA测序由上海立菲公司完成．1.2 方法

1.2.1 壮观链霉菌NRRL 2494的抗生素敏感性检测

采用SFM培养基，配制包括氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、硫链丝菌素、阿泊拉霉素、链霉素和萘啶酮酸在内的7种抗生素系列浓度平板，浓度分别为1，5，20，和50 mg/L．取新鲜的菌丝体划线展开于各个抗生素浓度梯度的固体平板上，置于28 °C培养箱中培养，从