谷丙转氨酶活性测定
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实验十七 谷丙转氨酶活性测定
Exp.17 Activity Determination of Glutamic Pyruvic Transaminase
一、实验原理
氨基移换酶也称转氨酶,为广泛存在于生物机 体内的酶，其作用为催化α-氨基酸的α- 氨基与 α- 酮酸的α- 酮基互换。因此在氨基酸的合成 和分解，尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中有 重要作用。转氨酶的种类甚多。 任何一种氨基酸 进行转氨作用时，都由其专一的转氨酶催化，它 们的最适pH接近7.4。
（4）2，4—二硝基苯肼溶液：
将A·R纯2，4—二硝基苯肼19.8mg加入200ml锥形瓶内， 加100ml 1N HCl液。2，4—二硝基苯肼溶解较慢，把锥形瓶 放在暗处不时摇动，全部溶解后，滤入褐色玻璃瓶。并置于 冰箱中保存。
（5）0.4N氢氧化钠液。 3、仪器设备
试管、吸量管、恒温水浴锅、分光光度计
2，4-二硝基苯肼/ ml 0.50
0.50
0.50 0.50 0.50 0.50
保温20 分钟
NaOH (0.4N)/ml
5
5
5
5
5
5
静置30 分钟
A520nm
2、谷丙转氨酶酶活力的测定
表2.谷丙转氨酶酶活力的测定
谷丙转氨酶底物/ml
1 测定管 0.50
2 “空白”对照管 0.50
37℃水浴保温10min，使管内外温度平衡
三、方法和步骤
1、肝匀浆制备： 取新鲜动物肝脏，用生理盐水冲洗，滤纸吸
干，称取肝脏0.5g，剪成小块，置于玻璃匀浆管 内，加入4.5ml预冷的pH 7.4 0.1 mol/L磷酸缓 冲液，制成10%肝匀浆，冰冻保存。
2、标准曲线的绘制
取6支试管分别用0、1、2、3、5标号，按下 表所列次序添加各试剂。
五、思考题
1.谷丙转氨酶活性测定的原理是什么? 2.在“空白”对照管中为什么也要加入肝匀浆?
COOH
COOH
CH3 (CH2)2 CHNH2+ C=O
百度文库
转氨酶 CH3
←→ C=O
(CH2)2 + CHNH2
COOH COOH
COOH COOH
丙氨酸 α -酮戊二酸 丙酮酸
谷氨酸
测定转氨酶活力的方法很多，如分光光度法，纸 上层析法等。在本方法中，谷丙转氨酶作用于丙氨 酸和α－酮戊二酸后，生成的丙酮酸与2,4－ 二硝 基苯肼作用生成丙酮酸2,4－ 二硝基苯腙。
稀释肝匀浆/ml
0.10
37℃水浴保温30分钟
2,4—二硝基苯肼试剂/ml
0.50
0.50
稀释肝匀浆/ml
0.10
保温20分钟，冷却
NaOH (0.4N) /ml
5.0
5.0
室温下静置30分钟
A520nm
四、实验结果
用光吸收值读数在操作曲线上查出转氨酶活力单位 数，计算
每100毫升稀释肝匀浆中转氨酶的活力单位数
取A·R丙酮酸钠11mg溶解于50ml 0.1M磷酸缓冲液 内（宜当日新配）。
（3）谷丙转氨酶底物：
取分析纯α－酮戊二酸29.2mg，DL—丙氨酸1.79g置于小 烧杯内，加1N NaOH约10ml至完全溶解。用1N NaOH或1N HCl校正其pH=7.4，加0.1M磷酸缓冲液稀释至100ml，然后加 氯仿数滴防腐，在冰箱内可保存一周。此溶液每1.0ml含α－ 酮戊二酸2.0微克分子，丙氨酸200微克分子。
在各种转氨酶中，谷氨酸-草酰乙酸转氨酶 （简称谷草转氨酶）及谷氨酸-丙酮酸转氨酶（简 称谷丙转氨酶）活力最强。
上述两种转氨酶均广泛存在于机体组织内， 在正常人血清中也有少量，机体发生肝炎。心肌 梗塞等病变时，血清中转氨酶活力显著增加，所 以在临床诊断上转氨酶活力的测定有重要意义。 它们的催化反应如下：
试剂
管号 0
1
2
3
4
5
丙酮酸钠标准液/ml 0.00
0.05
0.10 0.15 0.20 0.25
谷丙转氨酶底物/ml 0.50
0.45
0.40 0.35 0.30 0.25
磷酸缓冲溶液 0.10
0.10
0.10 0.10 0.10 0.10
(0.1M pH7.4) /ml
37℃水浴中保温， 平衡管 内外温 度
本方法中用分光光度法，根据硝基苯腙的生成 量可以计算酶的活力。
→
二、实验用品
1、材料 新鲜动物肝匀浆。
2、试剂 （1）0.1M磷酸缓冲液（pH=7.4）
取0.1M KH2PO4液50ml，0.1N NaOH液39.3ml， 再加蒸馏水10.7ml，混匀即得。 （2）丙酮酸钠标准液（2.0微克分子/ml）：
将试管于37℃水浴中保温，平衡管内外温度, 向各管内加0.5ml 2，4—二硝基苯肼后再保 温20分钟，
最后分别向各管内加入0.4N NaOH 5毫升，
在室温下静置30分钟后，
以0号管做“空白”用520nm进行比色，读出 光吸收值，以丙酮酸的微摩数为横坐标，光吸收 值为纵坐标，画出标准曲线。
表1.丙酮酸钠标准曲线的绘制
Exp.17 Activity Determination of Glutamic Pyruvic Transaminase
一、实验原理
氨基移换酶也称转氨酶,为广泛存在于生物机 体内的酶，其作用为催化α-氨基酸的α- 氨基与 α- 酮酸的α- 酮基互换。因此在氨基酸的合成 和分解，尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中有 重要作用。转氨酶的种类甚多。 任何一种氨基酸 进行转氨作用时，都由其专一的转氨酶催化，它 们的最适pH接近7.4。
（4）2，4—二硝基苯肼溶液：
将A·R纯2，4—二硝基苯肼19.8mg加入200ml锥形瓶内， 加100ml 1N HCl液。2，4—二硝基苯肼溶解较慢，把锥形瓶 放在暗处不时摇动，全部溶解后，滤入褐色玻璃瓶。并置于 冰箱中保存。
（5）0.4N氢氧化钠液。 3、仪器设备
试管、吸量管、恒温水浴锅、分光光度计
2，4-二硝基苯肼/ ml 0.50
0.50
0.50 0.50 0.50 0.50
保温20 分钟
NaOH (0.4N)/ml
5
5
5
5
5
5
静置30 分钟
A520nm
2、谷丙转氨酶酶活力的测定
表2.谷丙转氨酶酶活力的测定
谷丙转氨酶底物/ml
1 测定管 0.50
2 “空白”对照管 0.50
37℃水浴保温10min，使管内外温度平衡
三、方法和步骤
1、肝匀浆制备： 取新鲜动物肝脏，用生理盐水冲洗，滤纸吸
干，称取肝脏0.5g，剪成小块，置于玻璃匀浆管 内，加入4.5ml预冷的pH 7.4 0.1 mol/L磷酸缓 冲液，制成10%肝匀浆，冰冻保存。
2、标准曲线的绘制
取6支试管分别用0、1、2、3、5标号，按下 表所列次序添加各试剂。
五、思考题
1.谷丙转氨酶活性测定的原理是什么? 2.在“空白”对照管中为什么也要加入肝匀浆?
COOH
COOH
CH3 (CH2)2 CHNH2+ C=O
百度文库
转氨酶 CH3
←→ C=O
(CH2)2 + CHNH2
COOH COOH
COOH COOH
丙氨酸 α -酮戊二酸 丙酮酸
谷氨酸
测定转氨酶活力的方法很多，如分光光度法，纸 上层析法等。在本方法中，谷丙转氨酶作用于丙氨 酸和α－酮戊二酸后，生成的丙酮酸与2,4－ 二硝 基苯肼作用生成丙酮酸2,4－ 二硝基苯腙。
稀释肝匀浆/ml
0.10
37℃水浴保温30分钟
2,4—二硝基苯肼试剂/ml
0.50
0.50
稀释肝匀浆/ml
0.10
保温20分钟，冷却
NaOH (0.4N) /ml
5.0
5.0
室温下静置30分钟
A520nm
四、实验结果
用光吸收值读数在操作曲线上查出转氨酶活力单位 数，计算
每100毫升稀释肝匀浆中转氨酶的活力单位数
取A·R丙酮酸钠11mg溶解于50ml 0.1M磷酸缓冲液 内（宜当日新配）。
（3）谷丙转氨酶底物：
取分析纯α－酮戊二酸29.2mg，DL—丙氨酸1.79g置于小 烧杯内，加1N NaOH约10ml至完全溶解。用1N NaOH或1N HCl校正其pH=7.4，加0.1M磷酸缓冲液稀释至100ml，然后加 氯仿数滴防腐，在冰箱内可保存一周。此溶液每1.0ml含α－ 酮戊二酸2.0微克分子，丙氨酸200微克分子。
在各种转氨酶中，谷氨酸-草酰乙酸转氨酶 （简称谷草转氨酶）及谷氨酸-丙酮酸转氨酶（简 称谷丙转氨酶）活力最强。
上述两种转氨酶均广泛存在于机体组织内， 在正常人血清中也有少量，机体发生肝炎。心肌 梗塞等病变时，血清中转氨酶活力显著增加，所 以在临床诊断上转氨酶活力的测定有重要意义。 它们的催化反应如下：
试剂
管号 0
1
2
3
4
5
丙酮酸钠标准液/ml 0.00
0.05
0.10 0.15 0.20 0.25
谷丙转氨酶底物/ml 0.50
0.45
0.40 0.35 0.30 0.25
磷酸缓冲溶液 0.10
0.10
0.10 0.10 0.10 0.10
(0.1M pH7.4) /ml
37℃水浴中保温， 平衡管 内外温 度
本方法中用分光光度法，根据硝基苯腙的生成 量可以计算酶的活力。
→
二、实验用品
1、材料 新鲜动物肝匀浆。
2、试剂 （1）0.1M磷酸缓冲液（pH=7.4）
取0.1M KH2PO4液50ml，0.1N NaOH液39.3ml， 再加蒸馏水10.7ml，混匀即得。 （2）丙酮酸钠标准液（2.0微克分子/ml）：
将试管于37℃水浴中保温，平衡管内外温度, 向各管内加0.5ml 2，4—二硝基苯肼后再保 温20分钟，
最后分别向各管内加入0.4N NaOH 5毫升，
在室温下静置30分钟后，
以0号管做“空白”用520nm进行比色，读出 光吸收值，以丙酮酸的微摩数为横坐标，光吸收 值为纵坐标，画出标准曲线。
表1.丙酮酸钠标准曲线的绘制