石杉碱甲提取工艺研究
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文章中的检测结果是由成都市疾病预防与控制 中心的主任技师杨元教授提供 。 2. 2. 1 色谱柱
Diamonsil C18不锈钢柱 (250 mm ×4. 5 mm ,5μm) (Dikma) ;流动相 :氯仿2甲醇2氨水 (840∶24∶1. 2) ;流 速 :1 mL/ min ;柱温 :22 ℃;进样量 :10μL 。 2. 2. 2 检测波长
关键词 :石杉碱甲 ;制备工艺 ;提取 ;纯化 ;pH
中图分类号 :R28412
文献标识码 :A
Study on the Extraction of Huperzine A
LIU Jian2ting ,LI Yan , YAN Wei 3
( College of Life Science , Sichuan Normal University , Chengdu 610066 ,China)
1. 0 1. 5 2. 0 2. 5 3. 0 3. 5
Hup2A 的浓度 Hup2Aconcentration (mg/ kg)
20. 1 19. 3
23
21. 3 25. 7 19. 4
从表 2 可知 ,在酸提过程中 ,pH 为 3. 0 比较合 适。
3) 碱化 pH 值的确定 称取干燥千层塔粗粉 50 g ,加入 pH 为 3. 0 的酸 液 ,没有经过长时间的酸浸 ,直接进行提取 ,随后加 氨水使溶液呈不同的 pH 梯度 ,除杂后的提取液经 HPLC 测定 ,结果如表 3 。
Abstract : Huperzia serrata (Thunb) Trev. is raw material. Traditional method for alkaloid isolation was adopted. Namely ,The raw material was processed in hydrochloric acid and alkaloids were extracted by chloroform. The optimal extracting procedure was selected as following :1 :10 for the ratio of material to acid ,10 hours of soaking time ,subsequently ,material was processed 3 times in pH = 3. 0 ,55 ℃and 45 minutes each time ,acid was basified to pH = 9. 0. In the condition of pH 3. 0 ,impurities were removed by active carbon which were treated with acid liquid and 15 :100 for the ratio of solid to liquid. Obtain rate of Huperzia serrata (Thunb) Trev. is more than 79. 4 %. Key words :Huperzine A ;Processing ;extraction ;purification ;pH
Vol118
刘建廷等 :石杉碱甲提取工艺研究
299
2 材料和提取工艺
2. 1 材料及仪器 千层塔来源于重庆 ,经鉴定符合药典规定 。酒
石酸 (AR) 、氯仿 (AR) 、氨水 (CP) 无水甲醇 (AR) 、活 性炭 。
KQ2250DB 型数控超声波清洗器 (昆山市超声有 限公司) , 液晶 pH 计 , 离心机 (10000 rpm) , 蒸馏装 置 ,高效液相色谱 ( Integral 4000 型 PE 公司) 。 2. 2 色谱条件
表 1 不同种类的酸对 HUP2A 的浓度影响
Table 1 Effect of Hup2A concentration in different kinds of acid
酸的种类 Types of acid
柠檬酸 酒石酸 醋酸 磷酸 盐酸 Citric Tartaric Acetic Phospho Hydrochl acid acid acid ric acid oric acid
蛇足石杉 ( Huperzia serrata ( Thunb) Trev. ) 又名千 层塔 ,常用来治疗重症肌无力 、跌打损伤等症[1] 。八 十年代初 ,中国医药研究人员从其中分离出具有强 生物活性的石杉碱甲 ,是一种天然的 、高效的 、可逆 的第二代乙酰胆碱酯酶 (AChE) 抑制剂[122] ,对早老 年性痴呆症有显著疗效[224] 。石杉碱甲治疗指数高 , 作用时间长 ,无毒副作用[527] ,但在天然全草中含量 很低 。国内很多人应用高效液相色谱 、硅胶柱层析 等分离方法 ,虽然得率较高 ,但生产率很低 ,且生产 成本很高 。为寻求一条经济的提取技术路线 ,在大 量相关实验的基础上 ,总结出了比较经济的 、适合大 批量生产的提取方法 。
吡啶22 (1H) 酮 。它的化学结构[8]如图 1 所示 :
图 1 石杉碱甲的化学结构 Fig11 Chemical structure of Hupzine A
1. 2 石杉碱甲特点 石杉碱甲是从中草药千层塔中提取得到的生物
碱 , 是 一 种 高 效 、低 毒 和 可 逆 的 乙 酰 胆 碱 酯 酶 (AChE) 抑制剂[1 ,2] 。它具有与其他生物碱大体相同 的物理性质 ,采用经典生物碱提取方法 ,但其独特的 空间环和酰氨基使它具有与一般生物碱不同的特 点 ,就是用传统生物碱染色方法不能使其染色 ,但可 以用酸性乙醇2FeCl3 染色[9] ,使其呈黄绿色 。如果 有标准溶液 ,利用这个性质就可以用紫外扫描法粗 略测定其含量 。
2次
3次
4次
8
6. 56
6. 01
6. 2
10
6. 83
7. 87
7. 4
15
6. 84
7. 89
7. 26
结果显示 ,10 倍和 15 倍的氯仿量所得到的石 杉碱甲的量相差无几 ,故所用氯仿的体积量最好在 10 倍原料量 ,萃取 3 次 。
1) 酸种类的确定 在以上实验过程中没有加酸液过夜 ,其他条件 相同 (酸解时间 30 min ,氯仿萃取前 NH3·H2O 调 pH 值为 8. 5) ,做完后将样品放入冰箱保存 。通过高压 液相色谱分析 ,结果如表 1 。通过分析 ,这几种酸的
提取率在同一水平 ,根据成本核算以及在实验过程 中的可操作性 ,采用盐酸更经济合理 。
300
天然产物研究与开发 Vol118
4) 萃取次数与萃取倍比之间的双因子实验 称取 90 g 原料 ,在酸解 pH 值为 310 ,酸解时间 30 min ,酸解两次 ,碱化 pH 值在 910 条件下提取 ,所 得的酸液等分为 9 份 ,在不同条件下萃取 ,所得到的 有机相加入无水乙醇 ,使其体积都为 150 mL ,经高 效液相色谱测定 ,数据如下 :
1 石杉碱甲
1. 1 石杉碱甲的结构 石杉碱甲的化学名为 (5R ,9R ,11E) 52氨基2112
乙叉基25 ,6 ,9 ,102四氢272甲基25 ,92甲撑环辛并 (6)
收稿日期 :2005201221 接受日期 :2005203203 3 通讯作者 Tel :86228266062310 ; E2mail :ixzijt @sina. com
表 4 萃取过程中 ,所用氯仿量与萃取次数之间的关系
Table 4 Relation of quantum of chlofoform and extraction times
原料重量/ 氯仿体积 Raw material weight
Chloroform bulk (g/ V)
酸液/ 氯仿 Acid liquor/ Chloroform(V/ V)
Hup2A 的浓度 Hup2A concentration (mg/ kg)
16. 1
16. 2
15. 6
16. 3
15. 4 16. 3
结果表明 ,pH 值在 8. 0 、9. 0 、10. 0 处 , HUP2A 的 浓度大体在一个水平 。通过比较 HUP2A 的浓度数 据 ,再结合考虑碱化过程中 pH 8. 0 难以把握氨水的 滴定量 ,所以 pH 值为 9 、10 较为合适 。通过单因子 实验 ,虽然初步确定了酸的种类 、酸解 pH 值以及碱 化 pH 值的范围 ,但考虑到复合因素影响 ,故需要做 双因子实验 、正交实验来证实 。
表 3 在相同 pH 值的酸解 ,氨水碱化 pH 值对 HUP2A 的浓度 影响
Table 3 Effect of Hup2A concentration in different ammonia pH
and same HCl pH
碱化 pH 值 Basification pH value
7. 5 8. 0 8. 5 9. 0 9. 5 10
Huperzine A 紫外静态扫描有二个谱带 ,分别是 λ1 = 231. 3 nm ,λ2 = 310 nm。在此 HPLC 系统中 ,用 231. 3 nm 紫外检测基线不稳定 ,所以选定 310 nm 为 检测波长 。 213 提取工艺流程
千层塔干粗粉 →酸解 →调节 pH →氯仿抽提 → 浓缩 →纯化 →重结晶 →成品 2. 3. 1 总碱的制备
不同梯度酸液 ,其他条件完全相同 。不过夜酸浸 ,按
照总碱制备的实验方法提取 ,最后通过 HPLC 测定 ,
结果如表 2 。
表 2 盐酸的酸解 pH 值对 HUP2A 的浓度影响
Table 2 Effec百度文库 of Hup2A concentration in different HCl pH
酸解 pH 值 Extraction pH value
天然产物研究与开发 Nat Prod Res Dev 2006 ,18 :2982301
文章编号 :100126880 (2006) 0220298204
石杉碱甲提 取工艺研究
刘建廷 ,黎 艳 ,严 伟 3
(四川师范大学生命科学学院 ,成都 610066)
摘 要 :以蛇足石杉为原料 ,采用生物碱分离的传统方法 ,通过盐酸浸提 ,氯仿萃取来制取 、纯化石杉碱甲 ,选出
酸解 pH 值
2. 0 2. 0 2. 0 2. 0
2. 0
Extraction pH value
Hup2A 的浓度 Hup2A concentration 19. 7 22. 4 19. 4 19. 2 19. 7
(mg/ kg)
2) 盐酸酸解 pH 的确定
称取 10 g 干燥的千层塔粗粉 ,共 6 份 ,分别加入
取干燥的千层塔粗粉 10 g ,加入 10 倍体积的酸 溶液 ,浸泡 10 h (经实验观察 ,浸泡 10 h 就可以使其 充分吸水膨胀 、下沉 ,完全浸没在酸液中) ,用超声波 洗槽浸提 (频率为 100 次/ min) 30 min ,提取两次 ,合 并酸液 ;加氨水调 pH 至 9～10 ,再加氯仿萃取 ,每次 10 min ,然后合并氯仿 ;离心 (5000 rpm) 10 min ,去除 上层的水和杂质 ,颜色呈黄绿色 ;再在水浴中蒸馏浓 缩 ,呈膏状 ;最后加入无水甲醇 ,通过离心去除沉淀 或者在 4 ℃冰箱静置以分离沉淀 。如果需要更高的 纯度 ,可再用 3 倍体积酸液稀释 ,加入经过盐酸处理 的活性炭 ,处理 5～10 min ,除去活性炭 ,可以进行多 次萃取 、反萃取 、重结晶 ,纯度可达 90 %以上 。 2. 3. 2 预实验
最佳 、最经济的生产工艺配方是 :料液比为 1 :10 ,浸泡 10 h ,酸解 3 次 ,每次为 45 min ,酸解 pH 值为 3. 0 ,酸解温度
为 55 ℃,碱化 pH 为 9. 0 ;纯化过程中 ,用相当于石杉碱甲溶液体积 15 %的活性炭在 pH 为 3. 0 条件下除杂 ,石杉
碱甲的得率大于 79. 4 %。
Diamonsil C18不锈钢柱 (250 mm ×4. 5 mm ,5μm) (Dikma) ;流动相 :氯仿2甲醇2氨水 (840∶24∶1. 2) ;流 速 :1 mL/ min ;柱温 :22 ℃;进样量 :10μL 。 2. 2. 2 检测波长
关键词 :石杉碱甲 ;制备工艺 ;提取 ;纯化 ;pH
中图分类号 :R28412
文献标识码 :A
Study on the Extraction of Huperzine A
LIU Jian2ting ,LI Yan , YAN Wei 3
( College of Life Science , Sichuan Normal University , Chengdu 610066 ,China)
1. 0 1. 5 2. 0 2. 5 3. 0 3. 5
Hup2A 的浓度 Hup2Aconcentration (mg/ kg)
20. 1 19. 3
23
21. 3 25. 7 19. 4
从表 2 可知 ,在酸提过程中 ,pH 为 3. 0 比较合 适。
3) 碱化 pH 值的确定 称取干燥千层塔粗粉 50 g ,加入 pH 为 3. 0 的酸 液 ,没有经过长时间的酸浸 ,直接进行提取 ,随后加 氨水使溶液呈不同的 pH 梯度 ,除杂后的提取液经 HPLC 测定 ,结果如表 3 。
Abstract : Huperzia serrata (Thunb) Trev. is raw material. Traditional method for alkaloid isolation was adopted. Namely ,The raw material was processed in hydrochloric acid and alkaloids were extracted by chloroform. The optimal extracting procedure was selected as following :1 :10 for the ratio of material to acid ,10 hours of soaking time ,subsequently ,material was processed 3 times in pH = 3. 0 ,55 ℃and 45 minutes each time ,acid was basified to pH = 9. 0. In the condition of pH 3. 0 ,impurities were removed by active carbon which were treated with acid liquid and 15 :100 for the ratio of solid to liquid. Obtain rate of Huperzia serrata (Thunb) Trev. is more than 79. 4 %. Key words :Huperzine A ;Processing ;extraction ;purification ;pH
Vol118
刘建廷等 :石杉碱甲提取工艺研究
299
2 材料和提取工艺
2. 1 材料及仪器 千层塔来源于重庆 ,经鉴定符合药典规定 。酒
石酸 (AR) 、氯仿 (AR) 、氨水 (CP) 无水甲醇 (AR) 、活 性炭 。
KQ2250DB 型数控超声波清洗器 (昆山市超声有 限公司) , 液晶 pH 计 , 离心机 (10000 rpm) , 蒸馏装 置 ,高效液相色谱 ( Integral 4000 型 PE 公司) 。 2. 2 色谱条件
表 1 不同种类的酸对 HUP2A 的浓度影响
Table 1 Effect of Hup2A concentration in different kinds of acid
酸的种类 Types of acid
柠檬酸 酒石酸 醋酸 磷酸 盐酸 Citric Tartaric Acetic Phospho Hydrochl acid acid acid ric acid oric acid
蛇足石杉 ( Huperzia serrata ( Thunb) Trev. ) 又名千 层塔 ,常用来治疗重症肌无力 、跌打损伤等症[1] 。八 十年代初 ,中国医药研究人员从其中分离出具有强 生物活性的石杉碱甲 ,是一种天然的 、高效的 、可逆 的第二代乙酰胆碱酯酶 (AChE) 抑制剂[122] ,对早老 年性痴呆症有显著疗效[224] 。石杉碱甲治疗指数高 , 作用时间长 ,无毒副作用[527] ,但在天然全草中含量 很低 。国内很多人应用高效液相色谱 、硅胶柱层析 等分离方法 ,虽然得率较高 ,但生产率很低 ,且生产 成本很高 。为寻求一条经济的提取技术路线 ,在大 量相关实验的基础上 ,总结出了比较经济的 、适合大 批量生产的提取方法 。
吡啶22 (1H) 酮 。它的化学结构[8]如图 1 所示 :
图 1 石杉碱甲的化学结构 Fig11 Chemical structure of Hupzine A
1. 2 石杉碱甲特点 石杉碱甲是从中草药千层塔中提取得到的生物
碱 , 是 一 种 高 效 、低 毒 和 可 逆 的 乙 酰 胆 碱 酯 酶 (AChE) 抑制剂[1 ,2] 。它具有与其他生物碱大体相同 的物理性质 ,采用经典生物碱提取方法 ,但其独特的 空间环和酰氨基使它具有与一般生物碱不同的特 点 ,就是用传统生物碱染色方法不能使其染色 ,但可 以用酸性乙醇2FeCl3 染色[9] ,使其呈黄绿色 。如果 有标准溶液 ,利用这个性质就可以用紫外扫描法粗 略测定其含量 。
2次
3次
4次
8
6. 56
6. 01
6. 2
10
6. 83
7. 87
7. 4
15
6. 84
7. 89
7. 26
结果显示 ,10 倍和 15 倍的氯仿量所得到的石 杉碱甲的量相差无几 ,故所用氯仿的体积量最好在 10 倍原料量 ,萃取 3 次 。
1) 酸种类的确定 在以上实验过程中没有加酸液过夜 ,其他条件 相同 (酸解时间 30 min ,氯仿萃取前 NH3·H2O 调 pH 值为 8. 5) ,做完后将样品放入冰箱保存 。通过高压 液相色谱分析 ,结果如表 1 。通过分析 ,这几种酸的
提取率在同一水平 ,根据成本核算以及在实验过程 中的可操作性 ,采用盐酸更经济合理 。
300
天然产物研究与开发 Vol118
4) 萃取次数与萃取倍比之间的双因子实验 称取 90 g 原料 ,在酸解 pH 值为 310 ,酸解时间 30 min ,酸解两次 ,碱化 pH 值在 910 条件下提取 ,所 得的酸液等分为 9 份 ,在不同条件下萃取 ,所得到的 有机相加入无水乙醇 ,使其体积都为 150 mL ,经高 效液相色谱测定 ,数据如下 :
1 石杉碱甲
1. 1 石杉碱甲的结构 石杉碱甲的化学名为 (5R ,9R ,11E) 52氨基2112
乙叉基25 ,6 ,9 ,102四氢272甲基25 ,92甲撑环辛并 (6)
收稿日期 :2005201221 接受日期 :2005203203 3 通讯作者 Tel :86228266062310 ; E2mail :ixzijt @sina. com
表 4 萃取过程中 ,所用氯仿量与萃取次数之间的关系
Table 4 Relation of quantum of chlofoform and extraction times
原料重量/ 氯仿体积 Raw material weight
Chloroform bulk (g/ V)
酸液/ 氯仿 Acid liquor/ Chloroform(V/ V)
Hup2A 的浓度 Hup2A concentration (mg/ kg)
16. 1
16. 2
15. 6
16. 3
15. 4 16. 3
结果表明 ,pH 值在 8. 0 、9. 0 、10. 0 处 , HUP2A 的 浓度大体在一个水平 。通过比较 HUP2A 的浓度数 据 ,再结合考虑碱化过程中 pH 8. 0 难以把握氨水的 滴定量 ,所以 pH 值为 9 、10 较为合适 。通过单因子 实验 ,虽然初步确定了酸的种类 、酸解 pH 值以及碱 化 pH 值的范围 ,但考虑到复合因素影响 ,故需要做 双因子实验 、正交实验来证实 。
表 3 在相同 pH 值的酸解 ,氨水碱化 pH 值对 HUP2A 的浓度 影响
Table 3 Effect of Hup2A concentration in different ammonia pH
and same HCl pH
碱化 pH 值 Basification pH value
7. 5 8. 0 8. 5 9. 0 9. 5 10
Huperzine A 紫外静态扫描有二个谱带 ,分别是 λ1 = 231. 3 nm ,λ2 = 310 nm。在此 HPLC 系统中 ,用 231. 3 nm 紫外检测基线不稳定 ,所以选定 310 nm 为 检测波长 。 213 提取工艺流程
千层塔干粗粉 →酸解 →调节 pH →氯仿抽提 → 浓缩 →纯化 →重结晶 →成品 2. 3. 1 总碱的制备
不同梯度酸液 ,其他条件完全相同 。不过夜酸浸 ,按
照总碱制备的实验方法提取 ,最后通过 HPLC 测定 ,
结果如表 2 。
表 2 盐酸的酸解 pH 值对 HUP2A 的浓度影响
Table 2 Effec百度文库 of Hup2A concentration in different HCl pH
酸解 pH 值 Extraction pH value
天然产物研究与开发 Nat Prod Res Dev 2006 ,18 :2982301
文章编号 :100126880 (2006) 0220298204
石杉碱甲提 取工艺研究
刘建廷 ,黎 艳 ,严 伟 3
(四川师范大学生命科学学院 ,成都 610066)
摘 要 :以蛇足石杉为原料 ,采用生物碱分离的传统方法 ,通过盐酸浸提 ,氯仿萃取来制取 、纯化石杉碱甲 ,选出
酸解 pH 值
2. 0 2. 0 2. 0 2. 0
2. 0
Extraction pH value
Hup2A 的浓度 Hup2A concentration 19. 7 22. 4 19. 4 19. 2 19. 7
(mg/ kg)
2) 盐酸酸解 pH 的确定
称取 10 g 干燥的千层塔粗粉 ,共 6 份 ,分别加入
取干燥的千层塔粗粉 10 g ,加入 10 倍体积的酸 溶液 ,浸泡 10 h (经实验观察 ,浸泡 10 h 就可以使其 充分吸水膨胀 、下沉 ,完全浸没在酸液中) ,用超声波 洗槽浸提 (频率为 100 次/ min) 30 min ,提取两次 ,合 并酸液 ;加氨水调 pH 至 9～10 ,再加氯仿萃取 ,每次 10 min ,然后合并氯仿 ;离心 (5000 rpm) 10 min ,去除 上层的水和杂质 ,颜色呈黄绿色 ;再在水浴中蒸馏浓 缩 ,呈膏状 ;最后加入无水甲醇 ,通过离心去除沉淀 或者在 4 ℃冰箱静置以分离沉淀 。如果需要更高的 纯度 ,可再用 3 倍体积酸液稀释 ,加入经过盐酸处理 的活性炭 ,处理 5～10 min ,除去活性炭 ,可以进行多 次萃取 、反萃取 、重结晶 ,纯度可达 90 %以上 。 2. 3. 2 预实验
最佳 、最经济的生产工艺配方是 :料液比为 1 :10 ,浸泡 10 h ,酸解 3 次 ,每次为 45 min ,酸解 pH 值为 3. 0 ,酸解温度
为 55 ℃,碱化 pH 为 9. 0 ;纯化过程中 ,用相当于石杉碱甲溶液体积 15 %的活性炭在 pH 为 3. 0 条件下除杂 ,石杉
碱甲的得率大于 79. 4 %。