地衣芽孢杆菌发酵过程的优化

地衣芽孢杆菌发酵过程的优化
吴俊罡阎英凯刘吉华王梅雪
(大连开发区松岚街11号,大连翔大生物技术有限公司）
本文通过对培养基配方的调整和发酵培养过程中对发酵工艺的调整，从而节约生产中成本，提高了产量，通过实验所得的工艺条件不但大大降低了成本而且使产量在原有的基础上有了大幅度的提高，极大的提高了产品的市场竞争力。

关键词：地衣芽孢杆菌发酵
抗生素作为饲料添加剂，在畜禽防疫方面虽起到积极的作用，但近10多年来由于科学水平的提高，国外饲料业和饲养业中很多人反对用抗菌素做饲料添加，这是因为抗菌素在预防性应用时，其化学残留污染肉、蛋、奶；另外，抗菌素会抑制和杀死肠道内的有益菌群，造成肠道正常菌群生态失调，导致疫病的发生，出现二重感染，有害于人畜健康。

鉴于此，国内外专家学者对研究开发微生态制剂用于畜禽养殖日趋关注，从而也促进了这一产业的迅猛发展，国内用于制作微生态添加剂的主要是一些芽孢菌类和乳酸菌类，但长期以来生产成本一直居高不下，对企业的发展造成了障碍，本文阐述了如何通过对地衣芽孢菌发酵过程进行优化，来提高产量，降低生产成本。

１材料与方法
１.1材料
１.1.1菌种
地衣芽孢杆菌（Bacillus lichenniformis），大连翔大生物技术研究中心保存。

１.1.2主要试剂：淀粉、豆汁、硫酸锰、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾等。

１.1.3主要设备：控温摇床、蒸汽消毒器、托盘式扭力天平、显微镜、发酵罐等。

１.２方法
１.2.1检测方法
活菌计数采用平皿活菌计数法，芽孢率采用芽孢染色后显微镜下计算。

１.2.2 摇瓶正交实验
１.2.2.1 以一适合生产的经验培养基为基础进行正交试验
经验培养基为：淀粉1.0％尿素0.2％磷酸氢二钾0.6％磷酸二氢钾0.3％酵母膏0.04％硫酸镁0.1％硫酸锰0.02％豆汁1.0％
1 0.5 0.5 0.01 0.02
2 0.5 1.0 0.02 0.04
3 0.5 1.5 0.03 0.06
4 1.0 0.
5 0.03 0.06
5 1.0 1.0 0.02 0.04
6 1.0 1.5 0.01 0.02
7 1.5 0.5 0.03 0.04
8 1.5 1.0 0.01 0.06
9 1.5 1.5 0.02 0.02
注：每种配方中再加：尿素0.2％磷酸氢二钾0.6％磷酸二氢钾0.3％硫酸镁0.1％
１.2.3发酵罐培养实验
１.2.3.1以常用细菌培养基作为对照培养基（牛肉膏0.3%蛋白胨1.0%氯化钠0.5%PH7.0～7.5）操作如下：
用蒸汽对培养基进行灭菌，121℃灭菌20分钟，然后换空气保压，同时进行冷却，当温度达到最适培养温度（37℃）时将通气比调至1:0.5，接入种子，开动搅拌为200rpm，开始进行发酵培养(培养期间罐压要保持在0.04~0.06Mpa)，随着菌体的不断生长溶氧值也逐渐发生变化，因此需调通气比和搅拌转数使溶氧值相对值不低于20％以下（由于设备限制一般调通气比不超过1:1）。

取样检测，当空形芽孢率达到80%以上时，发酵结束。

１.2.3.2按正交实验得出的培养基作为发酵罐培养基进行发酵培养，操作方法同3.2.3.1。

１.2.3.3发酵培养基同3.2.3.2，但发酵过程中控制PH，防止PH低于6.5,使地衣芽孢杆菌始终生长在相对较适宜的PH范围之内，其他培养条件同3.2.3.1。

２结果
1 0.5 0.5 0.01 0.0
2 11.
3 45
2 0.5 1.0 0.02 0.04 15.9 80
3 0.5 1.5 0.03 0.06 14.7 31
4 1.0 0.
5 0.03 0.0
6 14.1 0
5 1.0 1.0 0.02 0.04 13.2 5
6 1.0 1.5 0.01 0.02 12.9 0
7 1.5 0.5 0.03 0.04 12.6 0
8 1.5 1.0 0.01 0.06 12.4 0
9 1.5 1.5 0.02 0.02 14.3 0
Ij 41.9 38.0 36.6 38.5
IIj 40.2 41.5 43.4 41.7
IIIj 39.3 41.9 41.4 41.2
Kj 3 3 3 3
Ij/Kj 13.97 12.67 12.2 12.83
IIj/Kj 13.4 13.83 14.47 13.9
IIIj/Kj 13.1 13.97 13.8 13.73
Dj 0.3 1.3 2.27 1.07
影响因素：硫酸锰＞豆汁＞酵母膏＞淀粉
最适培养基为：
淀粉0.5％尿素0.2％磷酸氢二钾0.6％磷酸二氢钾0.3％酵母膏0.04％硫酸镁0.1％硫酸锰0.02％豆汁1.0％
２.2发酵罐实验结果
２.2.1以常用细菌培养基作为对照培养基配方上罐发酵结果
发酵周期：48小时 芽孢形成率为：80% 活菌数为：15.4亿/毫升 ２.2.2用摇瓶实验得出的培养基配方上罐发酵结果
发酵周期：36小时 芽孢形成率为： 85% 活菌数为：24亿/毫升 ２.2.3发酵过程中控制PH 的培养结果
发酵周期：32小时 芽孢形成率为：95 % 活菌数为：30亿/毫升 ３讨论
因为我们所生产的产品为活菌制剂，所以最重要的控制指标是含活菌数,而只有形成芽孢才能利于活菌保存，因而我们的实验主要围绕活菌数和芽孢率这两项展开，又根据生产实际，我们又着重将发酵周期列为一个很重要的实验指标，
因为缩短发酵周期就意味着降低能
204060801002
6
10
14
18
22263034
38
42
48
相对值
时间（h ）
表1 肉汤培养基发酵曲线
1020304050607080901002
6
10
14
182226
30
34
相对值
时间（h ）
表二正交实验所得配方发酵曲线
204060801002
4
6
8101214161820222426283032
相对值
时间（h ）
表3 正交实验所得配方控制pH 所得发酵曲线
耗，节约生产成本，月生产批次的增加,即月产量的提高。

３.1正交实验结果讨论
我们做正交实验所采用的基本培养基原材料成本低、普遍易得,且从相关资料中我们查到添加淀粉和硫酸锰有促进芽孢菌形成芽孢的作用,我们根据这些设计了正交实验,并以活菌数为研究对象,并将芽孢形成情况作为参照，对正交实验结果进行了方差分析，通过分析我们得出影响因素：影响因素：硫酸锰＞豆汁＞酵母膏＞淀粉最适培养基为：淀粉0.5％尿素0.2％磷酸氢二钾0.6％磷酸二氢钾0.3％酵母膏0.04％硫酸镁0.1％硫酸锰0.02％豆汁1.0％PH7.0~7.5。

由于摇瓶的培养条件远不如发酵罐的培养条件，所以发酵周期等指标不如发酵罐的指标。

３.2发酵实验结果讨论
发酵罐培养我们做了对比实验，采用了三种方案，方案一是用以常用细菌培养基作为发酵培养基培养；方案二是用摇瓶实验得出的培养基配方作为发酵培养基培养；方案三是发酵培养基与第二种方案相同，但在发酵过程中控制PH, 防止PH低于6.5,使地衣芽孢杆菌始终
通过方案三与方案一对比可以看出: 方案三比方案一活菌数提高了94.8%；芽孢形成情况提高了15个百分点；发酵周期缩短了33.3%；培养基成本节约了82.1%；在各个指标上都远远优于方案一。

方案三与方案二对比，虽然方案二的培养基成本节约了2.38%（方案三由于发酵过程中为了控制PH而补加碱液发生的成本计入培养基成本中），但活菌数方面方案二却比方案三减少了25%，并且由于方案二比方案三发酵周期增加了11.1%，考虑到动力等方面成本，方案三要远远优于方案二发酵条件。

４结论
通过发酵过程优化后，我们实验所得到的培养条件要远高于普遍用的培养条件，我们此次实验得到比较好的生产发酵条件是：
培养基为：淀粉0.5％尿素0.2％磷酸氢二钾0.6％磷酸二氢钾0.3％酵母膏0.04％硫酸镁0.1％硫酸锰0.02％豆汁1.0％PH7.0~7.5。

通气比起始为：1：0.5
培养温度：37℃
搅拌转数：200rpm
发酵过程中控制溶氧相对值不低于20％
发酵过程中控制PH不低于6.5
发酵培养过程中保持罐压为: 0.04~0.06Mpa
参考文献
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辉益
２.《微生学教程》高等教育出版社出版1996年4月第一次印刷周德庆著
３.《微生物学》轻工业出版社1990年4月主编：张惠康
４.《微生态学杂志》中国农业大学出版社2001年第三期主编：康白
５.《微生物培养基的制造与应用》中国农业出版社出版1995年6月北京第一次印刷主编：陈天寿
６.《发酵过程优化原理与实践》化学工业出版社2002年3月第一版主编：陈坚、李寅７.《动物微生态学》中国农业出版社1994年8月第一版主编：何明清《现代工业发酵调控学》化学工业出版社2002年1月第一版主编：储炬、李友荣
８.《饲料广角》2003年11期《一株枯草芽孢杆菌发酵培养基的优化》作者：吴俊罡等９.《化工基础实验》化学工业出版社主编：冯亚云。