利用Red同源重组技术构建产L_苏氨酸的基因工程菌(1)
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本研究通 过分析 L-苏氨酸 的代谢途 径, 应用 R ed 同源重组技术敲除大肠杆菌 ITH R 中 L-苏 氨酸合成的 支路代谢途径中编码高丝氨酸转酰基酶的 m etA 基因和 编码苏氨酸脱 氢酶的 ilvA 基因, 分别构 建了单敲 除突 变菌和双敲除突变菌。将携带苏氨酸操纵子的工程质 粒 pWYE065转入突变株中, 进行 5 L 发酵罐连续发酵 培养, 结果表明阻断 L-苏氨酸的代 谢旁路途径 可以增 强 L-苏氨酸的积累。
WY 042
5c-CCGA AGGTGCCTGA GGTAAGGTG CTGAATCGCTTAACGA TCGACTATCACAGAAGATAACGG CTGACATGGGAATTAGC-3c
WY 019 5c-AGCGGCGAATA CTA ATAA C-3c
WY 020 5c-GGTTG TTGTTGCCTGTTC-3c
将过夜培养 12h 的含有 pKD 46 的大 肠杆菌 ITH R 按 100B1的量接种, 振荡培养至 OD600值约为 0. 2, 加 入
终浓度为 100 mm ol /L 的阿拉伯糖继续培养至 OD600为 0. 5 ~ 0. 6。将 50 m l过夜培养液冰浴至 0e , 4e 离心后 用去离子水重悬, 12 000r/m in 离心收集菌体; 用预冷到 0e 的 10%甘油洗 3次, 最后将菌体重悬于 600 Ll冷的 10% 的甘油中, 取 50 L l菌液与约 200 ng的打 靶分子 DNA 片段进行电转化 (电转化条件 1800 V, 5 m s)。电 击后立即加入 1 m l SOC 液体培养液。 37e 振荡培养 2 h, 涂布于 LB 平板 ( Cm r 34)筛选阳性克隆。
摘要 利用 Red 重组技术构建 不同基因突变 的 L-苏氨酸工 程菌大肠杆菌 ITHR, 研究单敲 除 m etA、ilvA 和双敲除 m etA、ilvA 基因后对 L-苏氨酸积累的影响。应用质粒 pKD46介导的 Red同源 重组系统, 通过第一次同源重组将拟敲除基因替换为氯霉素抗性基因, 再通过重组酶在 FRT 位点 发生第二次同源重组, 消除抗性基因, 成功敲除了菌株 ITHR 体内苏氨酸合成的代谢旁路途径中 的 m etA 和 ilvA 基因, 构建了三株不同的基因突变株。将携带苏氨酸操纵子的工程质粒 pWYE065 电转化入敲除不同基因的突变株中, 构建基因工程菌。经 5 L 发酵罐发酵产酸实验, 未敲除任何 基因的菌株 ITHR /pWYE 065 L-苏氨酸的 产量为 5. 55 ? 0. 51 g /L, m etA 基因 单敲除菌 株 ITHR vm etA / pWYE065 L-苏氨酸产量为 9. 77 ? 1. 83 g /L, ilvA 基因单敲除菌株 ITHRv ilvA / pWYE065 L-苏氨酸产量为 8. 65 ? 1. 42 g /L, 同时敲除 ilvA 和 m etA 基因的菌株 ITHRv m etA v ilvA / pWYE065 L-苏氨酸的产量增加到 13. 6 ? 1. 14 g /L。通过敲除 L-苏氨酸的旁路代谢途径中的关键酶的基因, 可以增强 L-苏氨酸积累的效果, 为 L-苏氨酸工程菌的进一步改造奠定了基础。 关键词 大肠杆菌 R ed同源重组 基因敲除 L-苏氨酸 发酵 中图分类号 Q784
表 1 本研究所用引物
T ab le 1 Pr im ers in th is study
Hale Waihona Puke Baidu
引物名
引物序列 ( 5c-3c)
WY
041
5c-TCTTCAGCTATCTGGATGTCTAAA CGTA TAAGCG TATGTA G TGAGGTAATCAGGTTTTGAGCGATTGTG TAGGCTGG A G-3c
80
中国生物工程杂志 China B io techno logy
Vo .l 30 No. 3 2010
1 材料与方法
1. 1 材料 1. 1. 1 菌株和质粒 大肠杆菌 ( E schericher coli ) ITH R 为天津科 技大学代 谢工程 研究室保 藏菌种。含 有 th r 操纵子的质粒 pWYE065( Cm r )为中国科学院工业微生 物与生物技术研究室保藏。质粒 pKD46( 温度敏感型, 含有受阿 拉伯 糖启动 子调 控的 exo、bet 和 gam 基 因, Am pr )、pKD 3(含有两端带有 FRT 位点的氯霉素抗性基 因, Cm r ), pCP20( 温度敏感型, 编码能够识别 FRT 位点 的 FLP重组酶, Cm r, Am pr ) 均由军 事科学院 生物工 程 研究所王恒梁研究员惠赠。 1. 1. 2 培养基 培养基见参考文献 [ 7] 。 1. 1. 3 主要试剂与仪器 限制性内切核酸酶、Ex-T aq DNA 聚合酶、dNTP、DL2000核酸 M arker等购自大连宝 生物工程有限公司; 酵母粉、胰蛋 白胨购 自英国 Oxoid 公司; 琼脂粉、DGL4000核酸 M arker购自北京鼎国生物 技术有限责任公司; 染色体 DNA 提取试剂盒和质粒提 取试剂盒等购自天根生 化科技 (北 京 ) 有限 公司; L-阿 拉伯糖、氨苄青霉素、氯霉素均购自美国 S igm a公司; 其 它葡萄糖、无机盐、有 机试剂等均 为国产 分析纯试 剂。 UVP凝胶成像仪 ( JY04S-3B, 北京君意东方电泳设备有 限 公 司 ); PCR 仪 [ 5332, 德 国 艾 本 德 股 份 公 司 ( EppendorfAG ) ]; 电泳仪 ( JY300C, 北京君意东方电泳 设备有限公司 ); 紫外分 光光度计 ( UV-1800, 上海美 普 达仪器有限公司 ); 5 L 四联离位灭菌发酵罐 ( B IOTECH 系列, 上海保兴生物设备 工程有限公司 ); 高效液相 色 谱 ( Ag ilent 1200系列, 安捷伦科技有限公司 )。 1. 2 引物设计与合成
WY 027 5c-GAGGTG ACA AAGCCTGGA C-3c
WY 028 5c-GGAAGTGGTG CTGG AAAACA-3c
1. 4 利用 R ed同源重组 技术敲除大肠 杆菌 ITHR 的 m etA 和 ilvA 基因 R ed同源重组系统如图 1所示, 在第一轮体内重组
过程中, 以 pKD46-R ed为介导, 在大肠杆 菌 ITH R 菌株 体内以带 56 bp同源臂的 ca t基因线性打靶序列替换其 染色体上的 m etA ( ilvA )目的基因, 通过氯霉素抗性筛选 获得重组子 ITHR v m etA J ca t ( ITH R v ilvA J cat )。在 第二轮体内重组过程 中, 将编码 FLP 位点特异 性重组 酶的 质 粒 pCP20 转 入 突 变 菌 株 ITHR v m etA J ca t ( ITH Rv m etA J ca t)中, 在含氨苄青霉素抗性的 50 m g/ L 平 板 上 培 养, 菌 落 PCR 筛 选 ITHR vm etA ( ITHR v ilvA ) 阳性 重组子。并在已敲除 菌株 ITH R vm etA 基 础上转入 pKD46 再敲除 ilvA 基因, 构建双敲除菌 ITHR vm etA v ilvA。 1. 5 质粒转化
通过电转化的方法将携带苏氨酸操纵子的工程质 粒 pWYE065分别 转入构 建的突 变菌 株 ITHR vm etA、 ITHRv ilvA 和 ITH R v m etA v ilvA 中, 通过 氯霉素 抗性 筛选阳性克隆, 得到基因工程菌。 1. 6 5 L 罐流加补料发酵
种子 培养: 接种 单菌 落于 LB 活 化平 板 ( Cm r 34 ) 37e 培 养 24h。 接种一 环菌 体于 200 m l种子 培养 基
2010, 30( 3)
闫继爱 等: 利用 R ed同源重组技术构建产 L-苏氨酸的基因工程菌
81
pW YE065与 ITHR / pW YE 065L-苏氨酸产量差异的统计 学意义 检 验 采 用 Coch ran 检 验 方 法 分 析 比 较; 菌 株 ITHR v m etA v ilvA / pW YE 065 与 ITH R /pWYE065 L-苏 氨酸产量差异的统计学意义检验采用 W ilcoxon 秩和检 验方法分析比较。p < 0. 05时结果具有统计学意义。
收稿日期: 2009-09-23 修回日期: 2009-11-04 * 国家 / 8630计划 ( 2006AA 02Z216 ) 资助项目 ** 通讯作者, 电子信箱: w enty@ im. ac. cn
苏氨酸生产菌 株, 由于随机 突变造成菌 体遗传背 景改 变、生产能力减 弱、发酵周期长, 不利于 进一步提 高产 量。而利用分子生 物学的研究 方法和 技术, 通过 对基 因的表达和调控进行有目的性的改造而构建的工程菌 株, 不产生次 级突 变, 代 谢副 产物 少, 产 量容 易 提高。 随着分子生 物学技术以 及系统代谢工 程理论 的发展, 更多的分子生 物学手段运 用于菌种的 构建和改 造, 以 提高生产菌 L-苏氨酸的产量。
采用 P rmi er 5. 0软件根据 G enB ank 中 m etA、ilvA 和 质粒 pKD 3中的 cat基因序列信息, 设计引物并由上 海 英骏生物技术公司合成, 引物序列见表 1, 其中下划 线 部分为同源臂序列。引物 WY 041 和 W Y042用于扩 增 ca t 基 因 以 替 换 m etA 基 因 编 码 区; 引 物 WY 019 和 W Y020为 m etA 基因敲除后重组菌鉴定引物, 两条引物 各位于打靶序列区的左右两侧; 引物 WY 039 和 WY 040 用于扩增 ca t基因以替换 ilvA 基因编码区; 引物 W Y027 和 W Y028为 ilvA 基因敲除后重组菌鉴定引物, 两条 引 物各位于打靶序列区的左右两侧。 1. 3 感受态的制备与电击转化 [ 8]
L-苏氨酸是人体必需的八种氨基酸之 一, 在食品、 医药等方面有极其重要的用途 [ 1-3] 。 L-苏氨酸是除谷氨 酸和赖氨 酸 外世 界 范围 内 年产 量 最 高的 氨 基 酸, 在 2005 年 L-苏氨酸的年产量约为 7 万吨 [ 4]。 L-苏氨酸生 产方法主要有化学合成法、酶解法和微生物发酵法 [ 5]。 由于成本低廉且废 弃物排放比 较少, 微生物 发酵法 是 目前工业生产 L-苏氨 酸的最常 用方法。目前, L-苏 氨 酸的 主 要 生 产 菌 株 有 黄 色 短 杆 菌 ( B rev ibacterium f lavum )、谷氨酸棒杆菌 (C orynebacterium g lutam icum )和 大肠杆菌 (E scherich ia coli), 而 E. coli 由于繁殖迅速、发 酵温度高、生理生化基础研究比 较深入等特征 成为 L苏氨酸生产的 最常 用菌 株 [ 6] 。为提 高 L-苏氨 酸的 产 量, 各种不同的育种方法被 广泛应用于 L-苏氨酸生 产 菌的选育。通过传统的化学和物理诱变技术选育的 L-
WY
039
5c-GCA ACCAG CG CCGA CAAAG GCGCG GTGCGCGATAA ATC GAAACTGGGGGGTTAA TA TTGAG CGATTGTGTAGGCTGGAG-3c
WY 040
5c-AATGA CGTTGTCGCG CGGGTAGG CCTGATAAG CGAAGCG CTATCAGGCATT TTTCCTAACGGCTGACATGGGAATTAGC-3c
中国生物工程杂志 China B io techno logy, 2010, 30( 3) : 79-84
利用 Red同源重组技术构建产 L-苏氨酸的基因工程菌*
闫继爱 1, 2 张 雪 1, 2 张 芸 2 左佃光 2 陈 宁 1 温廷益 2**
( 1 天津科技大学生物工程学院 天津 300457 2 中国科学院微生物研究所 北京 100101)
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5c-CCGA AGGTGCCTGA GGTAAGGTG CTGAATCGCTTAACGA TCGACTATCACAGAAGATAACGG CTGACATGGGAATTAGC-3c
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WY 020 5c-GGTTG TTGTTGCCTGTTC-3c
将过夜培养 12h 的含有 pKD 46 的大 肠杆菌 ITH R 按 100B1的量接种, 振荡培养至 OD600值约为 0. 2, 加 入
终浓度为 100 mm ol /L 的阿拉伯糖继续培养至 OD600为 0. 5 ~ 0. 6。将 50 m l过夜培养液冰浴至 0e , 4e 离心后 用去离子水重悬, 12 000r/m in 离心收集菌体; 用预冷到 0e 的 10%甘油洗 3次, 最后将菌体重悬于 600 Ll冷的 10% 的甘油中, 取 50 L l菌液与约 200 ng的打 靶分子 DNA 片段进行电转化 (电转化条件 1800 V, 5 m s)。电 击后立即加入 1 m l SOC 液体培养液。 37e 振荡培养 2 h, 涂布于 LB 平板 ( Cm r 34)筛选阳性克隆。
摘要 利用 Red 重组技术构建 不同基因突变 的 L-苏氨酸工 程菌大肠杆菌 ITHR, 研究单敲 除 m etA、ilvA 和双敲除 m etA、ilvA 基因后对 L-苏氨酸积累的影响。应用质粒 pKD46介导的 Red同源 重组系统, 通过第一次同源重组将拟敲除基因替换为氯霉素抗性基因, 再通过重组酶在 FRT 位点 发生第二次同源重组, 消除抗性基因, 成功敲除了菌株 ITHR 体内苏氨酸合成的代谢旁路途径中 的 m etA 和 ilvA 基因, 构建了三株不同的基因突变株。将携带苏氨酸操纵子的工程质粒 pWYE065 电转化入敲除不同基因的突变株中, 构建基因工程菌。经 5 L 发酵罐发酵产酸实验, 未敲除任何 基因的菌株 ITHR /pWYE 065 L-苏氨酸的 产量为 5. 55 ? 0. 51 g /L, m etA 基因 单敲除菌 株 ITHR vm etA / pWYE065 L-苏氨酸产量为 9. 77 ? 1. 83 g /L, ilvA 基因单敲除菌株 ITHRv ilvA / pWYE065 L-苏氨酸产量为 8. 65 ? 1. 42 g /L, 同时敲除 ilvA 和 m etA 基因的菌株 ITHRv m etA v ilvA / pWYE065 L-苏氨酸的产量增加到 13. 6 ? 1. 14 g /L。通过敲除 L-苏氨酸的旁路代谢途径中的关键酶的基因, 可以增强 L-苏氨酸积累的效果, 为 L-苏氨酸工程菌的进一步改造奠定了基础。 关键词 大肠杆菌 R ed同源重组 基因敲除 L-苏氨酸 发酵 中图分类号 Q784
表 1 本研究所用引物
T ab le 1 Pr im ers in th is study
Hale Waihona Puke Baidu
引物名
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中国生物工程杂志 China B io techno logy
Vo .l 30 No. 3 2010
1 材料与方法
1. 1 材料 1. 1. 1 菌株和质粒 大肠杆菌 ( E schericher coli ) ITH R 为天津科 技大学代 谢工程 研究室保 藏菌种。含 有 th r 操纵子的质粒 pWYE065( Cm r )为中国科学院工业微生 物与生物技术研究室保藏。质粒 pKD46( 温度敏感型, 含有受阿 拉伯 糖启动 子调 控的 exo、bet 和 gam 基 因, Am pr )、pKD 3(含有两端带有 FRT 位点的氯霉素抗性基 因, Cm r ), pCP20( 温度敏感型, 编码能够识别 FRT 位点 的 FLP重组酶, Cm r, Am pr ) 均由军 事科学院 生物工 程 研究所王恒梁研究员惠赠。 1. 1. 2 培养基 培养基见参考文献 [ 7] 。 1. 1. 3 主要试剂与仪器 限制性内切核酸酶、Ex-T aq DNA 聚合酶、dNTP、DL2000核酸 M arker等购自大连宝 生物工程有限公司; 酵母粉、胰蛋 白胨购 自英国 Oxoid 公司; 琼脂粉、DGL4000核酸 M arker购自北京鼎国生物 技术有限责任公司; 染色体 DNA 提取试剂盒和质粒提 取试剂盒等购自天根生 化科技 (北 京 ) 有限 公司; L-阿 拉伯糖、氨苄青霉素、氯霉素均购自美国 S igm a公司; 其 它葡萄糖、无机盐、有 机试剂等均 为国产 分析纯试 剂。 UVP凝胶成像仪 ( JY04S-3B, 北京君意东方电泳设备有 限 公 司 ); PCR 仪 [ 5332, 德 国 艾 本 德 股 份 公 司 ( EppendorfAG ) ]; 电泳仪 ( JY300C, 北京君意东方电泳 设备有限公司 ); 紫外分 光光度计 ( UV-1800, 上海美 普 达仪器有限公司 ); 5 L 四联离位灭菌发酵罐 ( B IOTECH 系列, 上海保兴生物设备 工程有限公司 ); 高效液相 色 谱 ( Ag ilent 1200系列, 安捷伦科技有限公司 )。 1. 2 引物设计与合成
WY 027 5c-GAGGTG ACA AAGCCTGGA C-3c
WY 028 5c-GGAAGTGGTG CTGG AAAACA-3c
1. 4 利用 R ed同源重组 技术敲除大肠 杆菌 ITHR 的 m etA 和 ilvA 基因 R ed同源重组系统如图 1所示, 在第一轮体内重组
过程中, 以 pKD46-R ed为介导, 在大肠杆 菌 ITH R 菌株 体内以带 56 bp同源臂的 ca t基因线性打靶序列替换其 染色体上的 m etA ( ilvA )目的基因, 通过氯霉素抗性筛选 获得重组子 ITHR v m etA J ca t ( ITH R v ilvA J cat )。在 第二轮体内重组过程 中, 将编码 FLP 位点特异 性重组 酶的 质 粒 pCP20 转 入 突 变 菌 株 ITHR v m etA J ca t ( ITH Rv m etA J ca t)中, 在含氨苄青霉素抗性的 50 m g/ L 平 板 上 培 养, 菌 落 PCR 筛 选 ITHR vm etA ( ITHR v ilvA ) 阳性 重组子。并在已敲除 菌株 ITH R vm etA 基 础上转入 pKD46 再敲除 ilvA 基因, 构建双敲除菌 ITHR vm etA v ilvA。 1. 5 质粒转化
通过电转化的方法将携带苏氨酸操纵子的工程质 粒 pWYE065分别 转入构 建的突 变菌 株 ITHR vm etA、 ITHRv ilvA 和 ITH R v m etA v ilvA 中, 通过 氯霉素 抗性 筛选阳性克隆, 得到基因工程菌。 1. 6 5 L 罐流加补料发酵
种子 培养: 接种 单菌 落于 LB 活 化平 板 ( Cm r 34 ) 37e 培 养 24h。 接种一 环菌 体于 200 m l种子 培养 基
2010, 30( 3)
闫继爱 等: 利用 R ed同源重组技术构建产 L-苏氨酸的基因工程菌
81
pW YE065与 ITHR / pW YE 065L-苏氨酸产量差异的统计 学意义 检 验 采 用 Coch ran 检 验 方 法 分 析 比 较; 菌 株 ITHR v m etA v ilvA / pW YE 065 与 ITH R /pWYE065 L-苏 氨酸产量差异的统计学意义检验采用 W ilcoxon 秩和检 验方法分析比较。p < 0. 05时结果具有统计学意义。
收稿日期: 2009-09-23 修回日期: 2009-11-04 * 国家 / 8630计划 ( 2006AA 02Z216 ) 资助项目 ** 通讯作者, 电子信箱: w enty@ im. ac. cn
苏氨酸生产菌 株, 由于随机 突变造成菌 体遗传背 景改 变、生产能力减 弱、发酵周期长, 不利于 进一步提 高产 量。而利用分子生 物学的研究 方法和 技术, 通过 对基 因的表达和调控进行有目的性的改造而构建的工程菌 株, 不产生次 级突 变, 代 谢副 产物 少, 产 量容 易 提高。 随着分子生 物学技术以 及系统代谢工 程理论 的发展, 更多的分子生 物学手段运 用于菌种的 构建和改 造, 以 提高生产菌 L-苏氨酸的产量。
采用 P rmi er 5. 0软件根据 G enB ank 中 m etA、ilvA 和 质粒 pKD 3中的 cat基因序列信息, 设计引物并由上 海 英骏生物技术公司合成, 引物序列见表 1, 其中下划 线 部分为同源臂序列。引物 WY 041 和 W Y042用于扩 增 ca t 基 因 以 替 换 m etA 基 因 编 码 区; 引 物 WY 019 和 W Y020为 m etA 基因敲除后重组菌鉴定引物, 两条引物 各位于打靶序列区的左右两侧; 引物 WY 039 和 WY 040 用于扩增 ca t基因以替换 ilvA 基因编码区; 引物 W Y027 和 W Y028为 ilvA 基因敲除后重组菌鉴定引物, 两条 引 物各位于打靶序列区的左右两侧。 1. 3 感受态的制备与电击转化 [ 8]
L-苏氨酸是人体必需的八种氨基酸之 一, 在食品、 医药等方面有极其重要的用途 [ 1-3] 。 L-苏氨酸是除谷氨 酸和赖氨 酸 外世 界 范围 内 年产 量 最 高的 氨 基 酸, 在 2005 年 L-苏氨酸的年产量约为 7 万吨 [ 4]。 L-苏氨酸生 产方法主要有化学合成法、酶解法和微生物发酵法 [ 5]。 由于成本低廉且废 弃物排放比 较少, 微生物 发酵法 是 目前工业生产 L-苏氨 酸的最常 用方法。目前, L-苏 氨 酸的 主 要 生 产 菌 株 有 黄 色 短 杆 菌 ( B rev ibacterium f lavum )、谷氨酸棒杆菌 (C orynebacterium g lutam icum )和 大肠杆菌 (E scherich ia coli), 而 E. coli 由于繁殖迅速、发 酵温度高、生理生化基础研究比 较深入等特征 成为 L苏氨酸生产的 最常 用菌 株 [ 6] 。为提 高 L-苏氨 酸的 产 量, 各种不同的育种方法被 广泛应用于 L-苏氨酸生 产 菌的选育。通过传统的化学和物理诱变技术选育的 L-
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中国生物工程杂志 China B io techno logy, 2010, 30( 3) : 79-84
利用 Red同源重组技术构建产 L-苏氨酸的基因工程菌*
闫继爱 1, 2 张 雪 1, 2 张 芸 2 左佃光 2 陈 宁 1 温廷益 2**
( 1 天津科技大学生物工程学院 天津 300457 2 中国科学院微生物研究所 北京 100101)