高效菌筛选方法及策略优秀课件

一、传统分离及驯化技术
纯化：1.菌落纯 2.菌株纯
1.菌落纯：从“种”的水平来说是纯的，其方 法有划线分离法、涂布分离法和稀释分离法。
2.菌株纯：较为精细的单孢子或单细胞分离法。 性能鉴定：菌的生长情况、酶活测定、效
果测定
自然选育是一种简便易行的选育方法。但自然选育的效 率低（10-8—10-10）。
三. 原生质体融合
原生质体融合特点： 1 杂交频率较高 2 遗传物质体传递更为完整 3 存在着两株以上亲株同时参与融合形
成融合子的可能 4 提高效果的潜力较大
三. 原生质体融合
3.1选择亲株：必须选遗传性状稳定且具有优势互补
的两个亲株，而且必须带有可以识别的遗传标记（多 为营养缺陷型或抗药性标记）。
率）→少数突变（突变率）→少数正变（正变率） →少数降解酶活增加幅度大（增加率）且要求稳 定
三. 原生质体融合
原生质体融合 (Protoplast fusion)指在一 定选择条件下，使遗传性状不同的两细胞的原 生质体发生融合，并进而发生遗传重组以产生 同时带有双亲性状的、遗传性稳定的融合子。
始于1976年，最早是在动物实验中发现的， 后来早微生物中得以应用。使细胞间基因重组 的频率大大提高了，已大于10-1 （而诱变育种 一般仅为10-6 ）。发生基因重组亲本的选择范 围更大，可以在不同种、属、科，甚至更远缘 的微生物之间进行。
三. 原生质体融合
在有些情况下，两种或多种微生物在共同存
在时才能降解某种污染物，单独存在时不能降解
该污染物，这可能是因为彼此为对方提供了生长
所必须的条件或为对方消除了生长的障碍，使得
它们在共存的条件下能够顺利降解环境污染物。
在这种情况下，可以采用原生质体融合技术 融合这两种微生物，融合子就会具备两个亲本的 基因与优点，能够降解某种环境污染物，这也是 目前污染治理工程菌制备的一个主要途径。
高效菌筛选方法及策略优秀课 件
第三章 高效有机物降解菌的构建 技术及策略
第一节 高效有机物降解菌的构建技 术
一、传统分离及驯化技术 二、诱变技术 三、细胞融合技术 四、基因重组技术 五、基因工程
第三章 高效有机物降解菌的构建技
术和策略
第二节 高效有机物降解菌的构建策略
一、优化污染物的降解途径
1.重组互补代谢途径
2.改变污染物代谢产物流向
3.同源基因体外随机拼接
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4.拓宽氧化酶的专一性
二、提高污染物生物可利用性
1.重组表面活性剂编码基因
2.重组污染物跨膜转运基因
三、增强细菌的环境适应性
1.增强细菌的抗毒能力
2.增强细菌的放射线耐受性
第一节 高效有机物降解菌的构建技术
一、传统分离及驯化技术 不经人工诱变，利用微生物的自然突变进行
二、诱变育种
诱变育种是人为地利用物理、化学 等因素，使诱变的细胞内遗传物质染色 体或DNA的片段发生缺失、易位、倒位、 重复等畸变，或DNA的某一部位发生改变 (又称点突变)，从而使微生物的遗传物 质DNA或其化学结构发生变化，引起微生 物的遗传变异。因此，诱发突变的频率 远大于自然突变。
诱变过程
三. 原生质体融合
3.3原生质体融合：融合促进剂：聚乙二醇（PEG，浓度 为25%－40%）可有效促进原生质体融合。
另外，紫外线照射和脉冲电场等物理因素处理也能促进 原生质体融合。
出发菌株的选择：
1.选择纯种作为出发菌株，借以排除异核体或异质体 的影响；
2.不仅效果好，而且要考虑其它形状，如生长快、营 养要求低等；
3.对诱变剂敏感的菌株；
4.选择已经诱变过的菌株。
诱变剂的选择（物理：紫外线、X射线等，化学：碱基类 似物，5-氟尿嘧啶；烷化剂，亚硝基胍，甲基磺酸乙酯） 要考虑诱变剂本身的特点，如紫外线作用于DNA分子的嘧 啶碱基，而亚硝酸主要作用于DNA分子的嘌呤碱基，两者 复合使用，突变谱宽，效果较好。
3.2原生质体制备：去除细胞壁是制备原生质体的
关键，一般采用酶解法去壁。多酶混合除壁效果较好。
影响因素：菌体前处理、菌龄、酶浓度、酶处理 温度、PH、渗透压稳定剂（不仅起保护原生质体免于 膨裂，而且还有助于酶和底物的结合。
原生质体对渗透压极其敏感，低渗引起细胞破裂。 多采用甘露醇、山梨醇、蔗糖等有机物和氯化钾和氯 化钠等无机物。稳定剂的浓度一般均在0.3-0.8mol/L 之间。
诱变过程
影响诱变效果的因素：
菌种的生理状态：对分裂中的细胞更 有效；
细胞悬浮液要求生理状态一致，为分 散均匀的单细胞或单孢子悬浮液（一方面 分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂， 另一方面可避免长出不纯菌落）。
诱变过程
诱变剂的剂量：诱变率随诱变剂量的增加 而提高，但达到一定程度后，再提高剂量，反 而会使诱变率下降，使负变异株多，因此，主 张用中等剂量，如75%-80%或更低剂量。
充分利用复合处理的协同效应。复合处理 可以将两种或多种诱变剂分先后或同时使用， 也可以用同一诱变剂重复使用。复合处理可扩 大突变的位点范围，使获得正突变菌株的可能 性增大。
筛选过程
特点：发生频率低；随机性大 过程：先初筛，后复筛，测突变菌株性能
诱变育种的基本筛选程序： 出发菌株→绝大多数个体死亡，少数存活（存活
采样 筛选
增殖培养 性能鉴定
纯种分离
一、传统分离及驯化技术
采样：应根据筛选的目的、微生物分布情况、 菌种的主要特征极其生态关系等因素，确定具 体时间、地点和目标物。
增殖：为提高分离效率，常以投其所好的原则 在培养基中添加特殊的养分，使其所需菌种的 数量相对增加。主要是利用不同微生物的生长 繁殖对环境和培养基的特殊要求进行富集培养 和要求，控制这些条件使之有利于某类和某种 微生物，而对其它微生物不利，再对培养时间 加以控制，可以达到初步的分离和富集目的。
菌种选育的过程称为自然选育或自然分离。 微生物自然突变有两种原因：
(1)自然环境中存在的低剂量的宇宙射线、各种 短波辐射、低浓度的诱变物质和微生物自身代谢 产生诱变物质的作用引起的突变； （2）在DNA的复制过程中所发生的错配。
一、传统分离及驯化技术
来源：土壤、水、空气、动植物极其腐败 残体、有机物污染地区、污水处理系统中。