沙棘酒清除自由基作用的研究

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DPPH·清 除 率 =[1 -(DPPH·)t/(DPPH·)t =0] × 100%。
式 中 :DPPH·t=0— ——体 系 中 DPPH·自 由 基 的 初始质量浓度(mg/mL);DPPH·t— ——t 时刻溶液中 DPPH·的质量浓度(mg/mL)。 1.3.4 羟自由基 OH·清除率的测定 采用邻二氮 菲-Fe2+氧化法测定 H2O2/Fe2+产生的 OH·[13]。 样品 中依次加入 0.005 mol/L 邻二氮菲溶液 0.6 mL、磷 酸盐缓冲溶液(pH7.4)0.4 mL、0.01 mol/L FeSO4 溶 液 0.3 mL、0.02 mol/L EDTA 溶液 0.3 mL、 蒸馏水
0.6 mL、样 品 液 1 mL、0.1% H2O2 0.8 mL,于 37 ℃ 保温 60 min,在 536 nm 处测定吸光度值(A 样品)。 以 1 mL 10%乙醇和 0.8 mL 蒸馏水替代样品液和 H2O2,测定空白吸光度值(A 空白)。 以 1 mL 11%乙 醇替代样品液,测定损伤吸光度值(A 损伤)。 计算羟 自由基清除率。
第 10 卷 第 1 期 2010 年2月
中国食品学报
Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology
Vol. 10 No. 1 Feb. 2 0 1 0
沙棘酒清除自由基作用的研究
牛广财 1,2 朱 丹 3 王 军 1* 王宪青 2 魏文毅 2 (1 东北林业大学博士后流动站 哈尔滨 150040 2 黑龙江八一农垦大学食品学院 黑龙江大庆 163319
抗坏血酸、草酸、无水乙醇、磷酸氢二钠、磷酸 二氢钠、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、邻二氮 菲、 硫酸亚铁、 过氧化氢、 三羟甲基氨基甲烷 (Tris)、邻苯三酚、亚硝酸钠、硝酸铝等为国产分析 纯 ;DPPH·(1,1- 二 苯 基 苦 基 苯 肼 自 由 基 ),sigma 公司; 芦丁标准品, 购自中国药品生物制品检定 所。
OH·清除率=[(A 样品-A 损 伤)/(A 空 白-A 损伤 )] × 100% 1.3.5 超氧阴离子自由基的清除试验 采用邻苯 三酚自氧化法[14]。 25 ℃恒温条件下,在 10mL 容量 瓶 中 加 入 pH 8.3 的 0.05 mol/L Tris-HCl 溶 液 5 mL、2 mmol/L 邻 苯 三 酚 0.2 mL, 加 待 测 酒 样 0.2 mL ( 对 照 管 不 加 样 品 ), 然 后 再 加 一 定 量 缓 冲 溶 液 至 体 系 总 体 积 9 mL,并 以 重 蒸 馏 水 为 参 比 ,最 后 加入邻苯三酚,迅速混匀。 用紫外可见光光度计在 波长 322 nm 处测定吸光度。 从第 30 秒开始每隔 30 s 测定 1 次,直到反应启动后第 9 分钟。 计算超 氧阴离子自由基清除率。
15.415x+0.0745 (R2=0.9996), 如 图 1 所 示 。 在 0.02~0.10 mg/mL 范围,DPPH·乙醇溶液与吸光度 值之间呈良好的线性相关关系。
吸 光 度/OD
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
y = 15.415x + 0.0745
0.4
R2 = 0.9996
稀释 2 倍的沙棘汁
18.44±0.28
2.07±0.02
沙棘酒(陈酿 1 个月)
16.24±0.22
2.42±0.06
沙棘酒(陈酿 6 个月)
10.03±0.15
2.18±0.07
沙棘酒(陈酿 18 个月)
6.38±0.13
1.8Biblioteka Baidu±0.05
2.2 沙棘酒对 DPPH·自由基的清除率 由 试 验 数 据 得 出 DPPH·回 归 方 程 y =
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中国食品学报
2010 年第 1 期
mg/100 mL(陈酿 18 个 月 ),该 值 大 约 是 原 汁 中 维 生 素 C 的 20%。 沙 棘 原 汁 中 的 总 黄 酮 量 为 3.63 mg/mL, 随 着 陈 酿 时 间 的 增 加 , 沙 棘 酒 中 总 黄 酮 含 量也递减, 但陈酿时间对沙棘酒中总黄酮含量的 影响不大。 陈酿 18 个月时沙棘酒中总黄酮含量为 1.86 mg/mL,约是沙棘原汁的 1/2。
关键词 沙棘酒; DPPH·自由基; 羟基自由基; 超氧阴离子自由基; 还原力 文章编号 1009-7848(2010)01-0036-06
沙棘(Hippophae rhamnoides L.)又名沙枣、醋 柳、酸棘、黑刺,是胡颓子科沙棘属落叶灌木或小 乔木。 沙棘果实富含各种维生素、氨基酸、微量元 素、黄 酮 、酚 酸 、超 氧 化 物 歧 化 酶 (SOD)等 营 养 成 分和活性物质,其中尤以维生素 C、黄酮类化合物 等成分的含量较高 , [1-3] 具 有 极 高 的 营 养 和 保 健 价 值。 美国及俄罗斯将沙棘果汁、果油作为宇航食品 的必需添加剂。 藏、蒙医学中将沙棘果作为消炎、 促进损伤组织再生的良药。 1977 年沙棘作为中药 列入《中华人民共和国药典》。 现代医学研究证实, 沙棘果具有抗衰老、清除自由基、抗辐射、提高免 疫 力 、抗 肿 瘤 等 作 用 [4-7], 是 一 种 不 可 多 得 的 保 健 食 品原料。 沙棘果汁具有清除自由基的作用。 闫秀英 等用沙棘汁灌胃大鼠,灌胃 1h 时大鼠体内的 SOD 活性显著增加,脂质过氧化物含量明显降低,提示 沙棘汁具有抗氧化作用, 可作为良好的自由基清 除 剂 [8]。
O2·清除率=[1-ΔA 样/ΔA 空)]×100% 式中,ΔA 样— ——加入待测酒样时的反应速率 (每秒吸光度变化 );ΔA 空— ——不加酒样时的反应 速率(每秒吸光度变化)。 1.3.6 还 原 能 力 的 测 定 采 用 Oyaizu 方 法 测 定 沙棘酒的还原能力[15]。 在 0.5 mL 样品溶液中分别 加入 0.2 mol/L 磷酸盐缓冲溶液(pH 6.6) 2.5 mL 和 1%铁氰化钾溶液 5 mL,混合均匀后置 50 ℃水 浴中反应 20 min, 然后加入 10%三氯乙酸溶液 5 mL,3 000 r/min 离心 10 min。 吸取上清液 2.5 mL, 加 入 蒸 馏 水 2.5 mL 和 0.1% 三 氯 化 铁 溶 液 0.5 mL。 在 700 nm 处测定样品的吸光值。 以与样品同 浓度的乙醇溶液为空白,吸光值越大,还原能力越 强。
0.2
0
0
0.05
0.10
0.15
质 量 浓 度 /mg·mL-1
图 1 DPPH·标准溶液的标准曲线 Fig.1 Standard curves of DPPH· standard solution
各沙棘果酒(汁)均能使紫红色 DPPH 溶液褪 色,表明沙棘果酒(汁)中含有能清除 DPPH·自由 基的物质。 由图 2 可知,各种沙棘果酒对 DPPH· 自由基有很强的清除作用, 清除率随果酒量的增
2 结果与分析
2.1 沙棘酒维生素 C 及总黄酮的含量 由表 1 可以看出陈酿时间对沙棘酒中的维生
素 C 含量影响很大。 在沙棘汁发酵成沙棘酒的过 程 中 ,维 生 素 C 的 损 失 较 大 ,由 原 汁 的 33.81 mg/ 100 mL 减至 16.24 mg/100 mL,而且随陈酿时间的 延长,沙棘酒中维生素 C 含量递减,由陈酿 1 个月 时的 16.24 mg/100 mL 减至陈酿 18 个月时的 6.38
表 1 各样品中维生素 C 含量和总黄酮含量(n=5)
Table 1 Vitamin C and flavonoids contents in each
samples(n=5)
样品
维生素 C 含量/ 总黄酮含量/ mg·(100mL)-1 mg·(100mL)-1
沙棘原汁
33.81±0.46
3.63±0.11
3 黑龙江八一农垦大学生命科学与技术学院 黑龙江大庆 163319)
摘要 目的:研究沙棘酒对自由基的清除作用。 方法:采用分光光度法测定沙棘酒对 DPPH·自由基、羟基自由基 和超氧阴离子自由基的清除作用,还原力的测定采用 Fe3+还原法。结果:不同陈酿时间的沙棘酒清除自由基的能 力不同,随着陈酿时间的延长,其清除自由基的能力呈下降趋势。 沙棘酒中维生素 C 含量与对 DPPH·自由基、 羟自由基和超氧阴离子自由基的清除率之间呈正相关关系, 但总黄酮含量与对上述自由基的清除率之间的相 关性不显著。 沙棘酒还原力与维生素 C 含量和总黄酮含量间均呈正相关关系。 结论:沙棘酒清除 DPPH·自由 基、羟自由基和超氧阴离子自由基的能力较强,具有良好的抗氧化性和保健功能。
加而上升。
DPPH 清除率/%
陈酿 1 个月沙棘酒
90
陈酿 6 个月沙棘酒
80
陈酿 18 个月沙棘酒
70
稀释 2 倍的沙棘汁
60
50
40
30
20
10
0
0
0.1
0.2
0.4
0.8
体 积 /mL
图 2 沙棘酒对 DPPH·自由基的清除作用 Fig.2 Scavenging effects of sea buckthorn
1 材料与方法
1.1 材料 沙棘汁由黑龙江省农科院浆果研究所提供,
其可溶性固形物含量 8%;白砂糖(食品级);自选 酵母菌 Y23 从沙棘果汁中分离, 初步鉴定为酵母 属 (Saccharomyces);沙 棘 酒 为 自 酿 ,酒 精 度 (V/V) 10.0%~10.5%,总 酸 (以 苹 果 酸 计 )7.5~7.7 g/L,pH 3.0~3.1。
操作要点: 调整初始糖度 20%(用可溶性固形 物 代 替 含 糖 量 ), 发 酵 温 度 25 ℃,SO2 添 加 量 80 mg/L,接 种 量 10%,按 要 求 接 入 已 培 养 24 h 的 菌 体浓度为 2.0×108 cfu/mL 的 Y23 酵母液。 在发酵 至残糖不再明显降低时去除酒脚, 在 15~18 ℃陈 酿。 1.3.2 沙棘酒(汁)中总黄酮含量和维生素 C 含量 的测定 总黄酮含量测定:以芦丁为标样,采用亚 硝酸钠-硝酸铝显色法测定总黄酮含量[9]。 维生素 C 含量测定:参考 张 培 方 法[10],色 谱 柱 ODS C18 反 相色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为 0.1% 草酸溶液,检测波长 262 nm。 1.3.3 DPPH·自由基清除率的测定 标准曲线的 绘制:标 准 称 取 DPPH·标 准 品 5 mg,用 乙 醇 定 容 至 100 mL,将 此 母 液 稀 释 成 不 同 的 浓 度 ,分 别 测 定吸光度,作标准曲线。 参考 Larrauri 和 Yokozawa 的方法并改进 。 [11-12] 吸取不同体积的沙棘酒样,加 入 4 mL 0.025 mg/mL DPPH 乙醇溶液,室温避光 静置 1 h 后,于 516 nm 处测定吸光值。 以样品的 加入量对 DPPH·清除率作图。
第 10 卷 第 1 期
沙棘酒清除自由基作用的研究
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1.2 试验仪器与设备 Agilent1200 高效液相色谱仪, 安捷伦科技有
限公司;T6 型紫外-可见分光光度计, 北京普析通 用 仪 器 设 备 公 司 ;TGL-16G 高 速 台 式 离 心 机 ,上 海安亭科学仪器厂;HH-4 数显恒温水浴锅,金坛 荣华仪器公司。 1.3 试验方法 1.3.1 沙 棘 酒 酿 造 工 艺 沙 棘 鲜 果 → 清 洗 → 破 碎→酶解→榨汁→去油→调整→灭菌→接种酵母 液→主发酵→倒酒→后发酵→陈酿→澄清→过 滤→除菌→成品。
生产高附加值的沙棘酒是我国沙棘果精深加
收稿日期: 2009-03-09 基金项目: 黑龙江省科技厅“十一五”重点科技攻关项目
(GB06B404-3) 作者简介: 牛广财,男,1971 年出生,博士后,副教授 通讯作者: 王军
工的一个方向。 可以解决沙棘果实季节性强、果汁 不耐储运的问题, 促进沙棘资源综合利用及深加 工,提高经济和社会效益。 在沙棘酒发酵过程中, 所用酵母菌和酿造工艺都会影响其清除自由基的 效果。 截至发稿前尚未见有关沙棘酒抗氧化性能 的研究报道。 本文采用不同的评价指标研究沙棘 酒的清除自由基作用, 为新型沙棘保健酒的开发 提供理论依据。
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