基因工程 第七章 酵母基因表达体系(55P)
第七章 酵母基因工程
Dividing Saccharomyces cerevisiae (baker’s yeast) cells
一. 酵母克隆载体
① 能在E.coli中克隆和扩增。 Ori ②有大肠杆菌的选择标记 Ampr、Tetr。 ③ 有酵母的选择标记 Leu2+、His+、Ura3+、Trp1+;
如pYF92:
pBR322 2m 酵母his 3+
2m质粒： 酿酒酵母的内源质粒，长度是2m 。含有自主 复制起始区ori和STB序列（使质粒在供体中维 持稳定）。
特点：
①很高的转化活性（103-105转化子/微克 DNA）. ②拷贝数多（25-100分子/细胞）。 ③比YRp稳定。
YEp24
亮氨酸lue2—β-异丙基苹果酸脱 氢酶
• 该酶是把丙酮酸转化成亮氨酸的代谢酶之 一．只要使用亮氨酸lue2突变的营养缺陷型 酵母作受体，载体上带有亮氨酸lue2基因就 能在不含亮氨酸的培养基上实现转化克隆 的筛选（书１７０页图）．
四. 酵母表达系统的特点
（1）优点 ①对其遗传学和生理学的研究比较深入。 ②小量培养和大规模反应器中都能生长。 ③已经分离出很强的启动子。 ④有翻译后的加工。 ⑤本身自然分泌很少，便于胞外蛋白的纯 化。 ⑥安全性高（FDA确认的安全生物），不 需要宿主的安全性检验。
④不稳定，容易丢失。
（3）着丝粒质粒(YCp) 在YRp质粒中插入酵母染色体的着丝粒 区。 YRp质粒 酵母着丝粒 特点： ①行为像染色体，能稳定遗传。 ②单拷贝存在。
③不易从细胞中提取。
（4）附加体型载体(YEp) 由大肠杆菌质粒、2m质粒及酵母染色体 DNA选择标记构成。 大肠杆菌质粒 2m质粒 酵母选择标记
酵母菌的遗传工程和表达系统
酵母菌的遗传工程和表达系统酵母菌是一种常见的单细胞真菌，广泛存在于自然界中。
由于其易于培养、生长速度快、基因组较小、剪接机制类似于哺乳动物细胞等优点，酵母菌成为了功能基因组学、代谢工程学、蛋白质工程学等领域中的重要模型生物。
而酵母菌的遗传工程和表达系统则为这些研究提供了基础和保障。
酵母菌的遗传工程主要包括基因克隆、拷贝数调控、基因敲除、基因组编辑、基因表达调控、代谢通路调控等方面。
其中，基因克隆是构建目的基因载体的重要步骤，一般通过 PCR 扩增或基于荧光报告基因的克隆方法来实现。
而拷贝数调控则指通过操纵载体的拷贝数，达到目的蛋白在酵母细胞中表达量的控制。
酵母菌具有高度重组能力以及泛素降解酶机制，因此基因敲除和基因组编辑等操作在酵母菌中较为容易实现。
基因表达调控则是酵母细胞酿酒业中的重要应用，通过调节转录、翻译后修饰等环节来实现产品的调控。
代谢通路调控则是通过调节酵母菌内一系列代谢酶的表达量或活性来增加特定产物的产量。
酵母菌的表达系统则包括基于质粒的表达和基于基因组的表达两种方式。
质粒表达是将目的基因克隆至质粒中，然后将质粒转化至酵母细胞中，通过调控拷贝数和选择适当的启动子及终止子等措施实现表达。
而基因组表达则是将基因克隆至某一位点上，在酵母菌表达生命周期较长的时期内带来更稳定的表达效果，尤其适用于连续表达大规模生物分子的场合。
同时，可以采用多个方面的策略来处理表达过程中可能出现的问题，从而进一步优化表达效率和表达质量。
例如在 translational initiation 上加入特定元件、利用内质网信号肽将蛋白定向到内质网，从而利用内质网发生的翻译后修饰增加表达质量等等。
总之，酵母菌的遗传工程和表达系统为现代生物技术研究和产业化提供了重要的平台，无论从理论研究还是实践应用的角度来看，都具有广泛的前景和应用价值。
我们期待，基于酵母菌的遗传工程和表达系统将吸引更多的生物学家、遗传学家、代谢工程师、蛋白质化学家等多个领域的专家和研究人员的关注，一起推进这一新兴领域的发展和进步。
酵母表达体系
酵母表达体系毕赤酵母是甲醇营养型，甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛和过氧化氢。
为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在过氧化物酶体里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。
由于醇氧化酶与O2 的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。
而调控产生醇氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。
毕赤酵母含有两种醇氧化物酶，AOX1 AOX2。
细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1 基因产物。
甲醇可紧密调节、诱导 AOX1 基因的高水平表达，为Mut+菌株，可占可溶性蛋白的30%以上。
AOX2 基因与AOX1 基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2 基因的菌株比带AOX1 基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts 菌株。
毕赤酵母表达外源蛋白：分泌型和胞内表达。
利用含有α因子序列的分泌型载体即可。
翻译后修饰：酿酒酵母与毕赤酵母大多数为N-连接糖基化高甘露糖型，毕赤酵母中蛋白转录后所增加的寡糖链长度（平均每个支链8-14 个甘露糖残基）比酿酒酵母中的（50-150 个甘露糖残基）短得多。
菌株：GS115 （ Mut+， Muts）和 KM71（Muts）分泌型载体:pPICZα A,B,and C(5’AOX1启动子，紧密型调节，甲醇诱导表达，α分泌信号介导的分泌表达，Zeocin抗性基因，C端含有6XHis标签)胞内表达型载体：pPICZ A,B,and C，一：分子克隆1.设计引物分泌型载体图谱：见酵母表达说明书（p13-pPICZ A，p14-pPICZ B,p15-pPICZ C）2.PCR扩增基因PCR反应体系（50μl）模板DNA 1μlForward Primer（10μM）1μlReverse Primer（10μM）1μldNTP Mixture(各2mM): 4μl5×PrimerSTAR buffer（Mg2+ plus）10μlPrimerSTAR DNA Polymerase 0.5μlddHO up to 50μl2PCR 反应流程预变性98℃ 2min变性98℃ 10sec退火56℃ 10sec 30个循环延伸72℃ 30sec完全延伸72℃ 10min保存4℃3.双酶切及其回收双酶切反应体系（40μl）DNA(空载体或目的基因) 30μlBamHⅠ 1.5μlXholⅠ 1.5μl10×Buffer K 4.0μl4.酶连接首先利用1%的琼脂糖电泳将双酶切后的PCR产物和载体进行分离,并通过胶回收试剂盒回收，按照目的基因和空载体的碱基摩尔比在1:3--1:9之间，一共吸取目的基因和空载体的总体积为5μl，在加入等量的5μl DNA快速连接试剂盒SolutionⅠ，16℃连接4-6h。
基因工程 第七章 酵母基因表达体系(55P)
• 该质粒上共有4个基因：FLP、REP1、 REP2和D．其中FLP基因的编码产物催化 两个IRS序列之间的同源重组，使质粒在A 与B两种形态中转化，REP1、REP2和D基 因均为控制质粒稳定性的反式作用因子编 码基因．上述基因共转录出7种不同分子量 的mRNA分子。
• 2u质粒还含3个顺式作用元件．其中单一的 自主复制子结构(ARS)位于一个IRs的边界 上，REP3(STB)区域是REP1和REP2蛋白 因子的结合位点．对质粒在细胞有丝分裂 时的均匀分配起着重要作用，FRT存在于 两个IRs序列中，大小为50bP，是FLP蛋白 的识别位点。
缺陷在于：
1. 表达效率相对低 2. 酵母常有密码子偏性，真核基因在其中表达时需要人工 修正。
酵母菌的基因工程
酵母菌作为基因工程受体菌的特征 酵母菌表达外源基因的优势
全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操
作简便 具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统
大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉 能将外源基因表达产物分泌至培养基中 不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全 基因工程受体系统（Generally Recognized As Safe
减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 泛素降解途径衰减的酿酒酵母 UBI4缺陷型： 在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI4基因表达，UBI4-突变 株正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要 低的多，因此UBI4缺陷突变株是外源基因表达理想的受 体。 UBA1缺陷型： UBA1编码泛素激活酶E1，UBA1突变株式致死性的，但 其等位基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导 的蛋白降解。 Ubc4-ubc5双突变型： 七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效。
酵母菌的基因工程课件
拷贝数为50-100个，分别携带K1 K2两种能使多种酵母菌致死的毒
反向重复序列
pGKL1 8.9 kb
素蛋白编码基因（a b g），同时含有毒素蛋白抗性基因。
酵母菌克隆表达质粒的构建
含有ARS的YRp质粒的构建
ARS为酵母菌中的自主复制序列，0.8-1.5kb，染色体上每30-40kb 就有一个ARS元件。酵母菌自主复制型质粒的构建组成包括复制子、标 记基因、提供克隆位点的大肠杆菌质粒DNA。
原生质体转化法的一个显著特点是，一个受体细胞可同时接纳 多个质粒分子，而且这种共转化的原生质体占转化子总数的25%～ 33%。
酵母菌的转化程序
碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化
7 酵母菌的基因工程
A 酵母菌作为基因工程受体菌的特征 酵母菌的分类学特征
酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细 胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子酵母 菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由56个属和500多个种组成。如 果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最 成熟的真核生物表达系统。
泛素降解途径衰减的酿酒酵母
UBI 4缺陷型： 在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI 4基因表达，UBI 4-突变株能 正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多， 因此UBI 4缺陷突变株是外源基因表达理想的受体
UBA 1缺陷型： UBA1编码泛素激活酶E1，UBA1突变株是致死性的，但其等位 基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解
生物效应
改善重组蛋白分泌 提高重组蛋白表达 提高重组蛋白表达 提高重组蛋白表达 改善重组蛋白分泌 提高重组蛋白表达
作用位点
钙离子依赖型的ATP酶 转录后加工 转录水平 转录水平 羧肽酶Y 转录水平
基因工程-外源基因在酵母菌中的表达
基因工程刘夫锋2019.11.27基因工程5 2 3 4 1 6789重组DNA 技术与基因工程的基本概念重组DNA技术与基因工程的基本原理重组DNA技术所需的基本条件重组DNA技术的操作过程目的基因的克隆与基因文库的构建外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在酵母菌中的表达外源基因在哺乳动物细胞中的表达外源基因表达产物的分离纯化7.1酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征7 外源基因在酵母菌中的表达酵母菌的分类学特征酵母菌（Yeast ）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子酵母菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由56个属和500多个种组成。
如果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最成熟的真核生物表达系统。
7.1 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征7 外源基因在酵母菌中的表达酵母菌表达外源基因的优势全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作相对简单能将外源基因表达产物分泌至培养基中具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA 认定为安全的基因工程受体系统，食品工业有数百年历史酵母菌是最简单的真核模式生物7.2 酵母菌的宿主系统7 外源基因在酵母菌中的表达7.2.2提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌7.2.3 抑制超糖基化作用的突变宿主菌7.2.4 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌7.2.1 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌7.2.1 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括：酵母属如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae ）克鲁维酵母属如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis ）毕赤酵母属如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris ）裂殖酵母属如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe ）汉逊酵母属如多态汉逊酵母（Hansenula polymorpha ）裂殖酵母属如粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe ）如解脂耶氏酵母（耶氏酵母属Yarrowia lipolytica ）如腺嘌呤阿氏酵母（阿氏酵母属Arxula adeninivorans ）其中芽殖型酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽。
7酵母表达系统
切除蛋白质内含子
有些mRNA翻译的最初产物具有内含子（intein）序列，位 于多肽链序列的中间，经剪接后，蛋白质的外显子（ extein）才能连接成为成熟的蛋白质。
3、蛋白质的化学修饰
简单的化学修饰：
将乙酰基、甲基、磷酸基等小基团加到氨基酸侧链 上，或者加到氨基端或羧基端
不同蛋白质可以有完全相同的修饰
基因工程
1 基因工程的基本概念 2 基因工程的基本原理 3 基因工程所需的基本条件 4 基因因工程 8 哺乳动物基因工程
9 高等植物基因工程
真核生物基因表达
的调控机制
真核生物的基因表达过程
真核生物可以在多个层次上对基 因表达进行调控
两条链由两个二硫键连接成有生物活性的胰岛素。
多聚蛋白质的切割
有些新合成的多肽链含有几个蛋白质分子的序列，切 割以后产生具有不同功能的蛋白质分子。
如脑下丘腺产生的一种多肽链，包括4种不同的激素， 经蛋白酶切割以后成型。 在不同的细胞中切割的方式和位点不同，从而产生多 种不同的激素，适应不同细胞生长发育的需要。
Positive regulation
增强子的特性:
无方向性：上游或下游 无位置或距离特异性 对应不同的转录因子有不同的结合位点 在不同的组织或器官和不同的发育时期，不同 的增强子介入。
与转录阻遏物结合的DNA位点为沉默子
Repressor
No transcription
Transcription
Different RNA polymerase has different promoters: （启动子）promoter I, promoter II and promoter III
转录水平的调控
酵母表达系统
比较基因组学
通过比较不同物种之间的基因组 和转录组，分析生物进化的特征 和规律。
05 酵母表达系统的未来发展
提高表达产物的产量与质量
基因编辑技术
利用基因编辑技术，如CRISPR-Cas9，对酵母基因进行精确修饰， 以提高目标蛋白的表达量和纯度。
沉默子
沉默子是能够抑制基因表达的DNA序列，通过与转录因子结合来抑制基因的表达，在基因表达调控中具有重要作 用。
转录因子与基因表达调控
转录因子
转录因子是能够识别并结合DNA序列的蛋白质，通过与特定DNA序列的结合来调控基因的表达。
转录因子与基因表达调控
转录因子在基因表达调控中发挥关键作用，通过与启动子、增强子或沉默子等DNA序列的相互作用来 调节基因的表达。
蛋白质相互作用
通过酵母双杂交等技术研究蛋白质之间的相互作用，揭示基因调控 的分子机制。
基因突变分析
通过构建突变体分析基因突变对酵母生长、代谢等的影响，研究基因 的功能。
生物进化研究
物种进化
利用酵母表达系统研究物种之间 的进化关系，通过比较不同物种 之间基因表达的差异，揭示物种 进化的规律。
适应性进化
利用酵母表达系统生产食品添 加剂、酶制剂等，提高食品质 量和安全性。
农业领域
通过酵母表达系统改良农作物 ，提高抗逆性、产量和品质等
。
酵母表达系统的优缺点
优点
操作简便、周期短、成本低、可大规 模生产、安全性高。
缺点
表达水平相对较低、分泌蛋白的加工 和修饰能力有限、易受宿主菌遗传背 景的影响。
02 酵母表达系统的基本组成
对启动子、终止子等表达元件进行优化，提高其转 录和翻译效率，促进目标蛋白的表达。
外源基因在酵母体系中表达90页PPT
谢谢
11、越是没有本领的就越加自命不凡。——邓拓 12、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。——爱尔兰 13、知人者智，自知者明。胜人者有力，自胜者强。——老子 14、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。——歌德 15、最具挑战性的挑战莫过于提升自我。——迈克尔·F·斯特利
33、如果惧怕前面跌宕的山岩，生命 就永远 只能是 死水一 潭。 34、当你眼泪忍不住要流出来的时候 ，睁大 眼睛， 千万别 眨眼!你会看到 世界由 清晰变 模糊的 全过程 ，心会 在你泪 水落下 的那一 刻变得 清澈明 晰。盐 。注定 要融化 的，也 许是用 眼泪的 方式。
35、不要以为自己成功一次就可以了 ，也不 要以为 过去的 光荣可 以被永 远肯定 。
外源基因在酵母体系中表达
31、别人笑我太疯癫，我笑他人看不 穿。(名 言网) 32、我不想听失意者的哭泣，抱怨者 的牢骚 ，这是 羊群中 的瘟疫 ，我不 能被它 传染。 我要尽 量避免 绝望， 辛勤耕 耘，忍 受苦楚 。我一 试再试 ，争取 每天的 成功， 避免以 失败收 常在别 人停滞 不前时 ，我继 续拼搏 。
基因工程中酵母菌表达系统的特点和作用
将转化物接种HIS4缺陷平板进行第一轮筛选。
用不同浓度的G418平板进行第二轮筛选。
挑选10－20个克隆进行小规模诱导培养，鉴定外源基因的表达量。
挑选高水平表达菌株进行大规模诱导培养以制备外源基因的表达蛋白质。
另外，还时常遇到表达产物的过度糖基化情况。因此，表达系统应根据具体情况作适当的改进。
二、常用酵母表达系统（宿主－载体系统）
（1）酿酒酵母表达系统
酿酒酵母难于高密度培养，分泌效率低，几乎不分泌分子量大于30
kD的外源蛋白质，也不能使所表达的外源蛋白质正确糖基化，而且表达蛋白质的C端往往被截短。因此，一般不用酿酒酵母做重组蛋白质表达的宿主菌。
一、酵母表达系统的特点
酵母是一种单细胞低等真核生物，培养条件普通，生长繁殖速度迅速，能够耐受较高的流体静压，用于表达基因工程产品时，可以大规模加工能力，收获的外源蛋白质具有一定程度上的折叠加工和糖基化修饰，性质较原核表达的蛋白质更加稳定，特别适合于表达真核生物基因和制备有功能的表达蛋白质。某些酵母表达系统具有外分泌信号序列，能够将所表达的外源蛋白质分泌到细胞外，因此很容易纯化。
巴斯德毕赤酵母具有翻译后修饰功能，如信号肽加工、蛋白质折叠、二硫键形成和糖基化作用等其与糖基化位点其他哺乳动物细胞相同。
（3）裂殖酵母表达系统
裂殖酵母不同于其他酵母菌株，它具有许多与高等真核细胞相似的特性，它所表达的外源基因产物具有相应天然蛋白质的构象和活性。遗憾的是，目前对它的研究较少。
酿酒酵母本身含有质粒，其表达载体可以有自主复制型和整合型两种。自主复制型质粒通常有30个或更多的拷贝，含有自动复制序列（ARS），能够独立于酵母染色体外进行复制
，如果没有选择压力，这些质粒往往不稳定。整合型质粒不含ARS，必需整合到染色体上，随染色体复制而复制。整合过程是高特异性的，但是拷贝数很低。
酵母基因工程共43页文档
酵母基因工程
6、最大的骄傲于最大的自卑都表示心灵的最软弱无力。——斯宾诺莎 7、自知之明是最难得的知识。——西班牙 8、勇气通往天堂，怯懦通往地狱。——塞内加 9、有时候读书是一种巧妙地避开思考的方法。——赫尔普斯 10、阅读一切好书如同和过去最杰出的人谈话。——笛卡儿
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第七章酵母基因工程-BiotechnologyServ
•7 酵母基因工程
•A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特 •征B 酵母菌的宿主系统 •C 酵母菌的载体系统 •D 酵母菌的转化系统 E 酵母菌的表达系统 •F 利用重组酵母生产乙肝疫苗
•7 酵母基因工程
A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征
•酵母菌的分类学特征
• 酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单 •胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子 母•菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由56个属和500多个种组成 •果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌 最•成熟的真核生物表达系统。
•7 酵母基因工程
A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征
•酵母菌表达外源基因的优势
•全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简 便•具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统 •大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉 •能将外源基因表达产物分泌至培养基中 •不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全 的 •基因工程受体系统（Generally Recognized As Safe G •酵母菌是最简单的真核模式生物
•提高重组蛋白表达产率的突变宿主 •能导致酿酒酵母中重组蛋白产菌量提高或质量改善的突变类型
•突变类 型
•ssc1 •ssc2 •rgr1 •ose1 •ssc11 •rho-
•生物效 应 改善重组蛋白分泌 提高重组蛋白表达 提高重组蛋白表达 提高重组蛋白表达 改善重组蛋白分泌 提高重组蛋白表达
•作用位 点 钙离子依赖型的ATP酶 转录后加工 转录水平 转录水平 羧肽酶Y 转录水平
母•UBI 4缺陷型：
•在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI 4基因表达，UBI 4-突变株 能•正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多 •因此UBI 4缺陷突变株是外源基因表达理想的受体 •UBA 1缺陷型： •UBA1编码泛素激活酶E1，UBA1突变株是致死性的，但其 •基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解 •Ubc4 - ubc5 双突变型： •七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效
《酵母基因工程》课件
利用酵母细胞生产某些药物的活性成分或中间体，可降低生产成本和提高产量。
改良农作物和食品品质
农作物改良
通过基因工程技术将优良性状基因转入酵母细胞，再将其返回植物细胞，实现农作物的 遗传改良，提高产量和抗逆性。
食品品质
通过酵母基因工程改良食品加工过程中的菌种，提高食品的口感、营养价值和安全性。
基因治疗和基因组编辑
基因治疗
利用酵母基因工程技术将正常基因转入 病变细胞，替代或修复缺陷基因，从而 达到治疗遗传性疾病和恶性肿瘤的目的 。
VS
基因组编辑
通过酵母基因工程技术实现精准的基因组 编辑，如CRISPR-Cas9系统，可对人类 、动物和植物的基因进行精确的敲除、插 入和突变等操作，为遗传疾病治疗、农作 物改良等领域提供有力工具。
04
CATALOGUE
酵母基因工程面临的挑战和解决方案
基因表达调控的复杂性
总结词
酵母基因表达调控涉及多个层面，包括转录 、转录后和翻译后调控，具有高度复杂性。
详细描述
酵母基因表达调控涉及转录因子、顺式元件 和反式元件之间的相互作用，以及mRNA的 稳定性、翻译效率和蛋白修饰等。这些因素 共同决定了基因的表达水平和细胞命运。
02
CATALOGUE
酵母基因工程的工具和技术
基因克隆和鉴定技术 样本中分离出来，获得其DNA序 列的过程。
基因鉴定
利用分子生物学技术，如测序、 基因表达谱分析等，对克隆得到 的基因进行功能、结构和表达特 征的鉴定。
酵母转化技术
药物。
基因治疗
利用酵母作为载体，将 外源基因导入人体细胞 内，治疗遗传性疾病和
癌症。
生物能源
通过基因工程手段改良 酵母，提高其生物燃料
《酵母表达系统》课件
达。
单顺反子载体和多顺反子载体
03
分别用于表达单拷贝和多拷贝基因。
诱导表达系统
组成型表达
外源基因在宿主菌中持续表达。
诱导型表达
通过添加诱导物或改变培养条件来启动或增强外源基因的表达。
组成型与诱导型表达的比较
组成型表达稳定，但表达水平较低；诱导型表达水平较高，但操作 复杂。
转录和翻译调控元件
转录调控元件
表达载体的优化设计
表达载体的优化设计是提高酵母表达系统效率的另一个关键 因素。通过调整表达载体中的启动子、多克隆位点、终止子 等元件，可以实现对外源蛋白表达的精细调控。
例如，选择强启动子来驱动外源基因的表达，可以显著提高 目标蛋白的表达量。同时，合适的终止子可以确保外源基因 的正确转录和终止。
诱导表达系统的改进
诱导表达系统的改进是提高酵母表达系统效率的重要手段 之一。通过调整诱导剂的种类和浓度，可以实现对外源蛋 白表达的诱导和调控。
例如，利用组成型表达和诱导型表达两种方式来表达外源 蛋白，可以实现在特定条件下对目标蛋白的高效表达。
转录和翻译调控元件的调整
转录和翻译调控元件的调整是提高酵 母表达系统效率的关键因素之一。通 过调整转录和翻译过程中的各种元件 ，可以实现对目标蛋白表达的精细调 控。
科学研究
用于研究基因功能、蛋白质相 互作用等。
酵母表达系统的优势与局限性
优势 繁殖快，容易培养，可在短时间内获得大量表达产物。
操作简便，成本低，适合大规模生产。
酵母表达系统的优势与局限性
可通过基因工程手段对酵母进行改造 ，提高表达产物的产量和质量。
可用于生产多种类型的蛋白质和多糖 。
酵母表达系统的优势与局限性
01
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发展历程
1. 1974年rlarck—walker和Miklos发现在大多数酿 酒酵母中存在质粒。 2. 1978年Hmnen将来自一株酿酒酵母的leu 2基因 导入另一株酿酒酵母，弥补了后者的Leu2缺陷， 标志着酵母表达系统的建立。 3. 1981年Hinnen等用酵母基因表达系统表达了人 干扰素。 4. 我国也在1983年首次用酵母菌表达了乙型肝炎 病毒表面抗原基因。 5. 1996年在全世界科学家的通力合作下，完成了 第一个真核生物——酿酒酵母全基因组的测序。
2u质粒
• 几乎所有的酿酒酵母菌株中都存在一个 6318bp大小的野生型2u双链环状质粒，它 在宿主细胞核内的拷贝数可维持在50-100之 间，呈核小体结构，其复制的控制模式与染 色体DNA完全相同。2u质粒上含有两个相 互分开的599bp长反向重复序列(IRs)，两者 在某种条件下可发生同源重组，形成两种不 同的形态(A和B)。
在寄主细胞内极其稳定性主要由两个因素决 定： • 第一，2u质粒在细胞分裂时可将其复制拷 贝均分给母细胞和子细胞. • 第二，当细胞中质粒拷贝数因某些原因减少 时，2u质粒可通过自我扩增自动调节其拷 贝数水平。 • 上述两种复制特性均与FLP蛋白的作用密切 相关，这是2u质粒以有限的复制次数获得 高拷贝的主要机制。
突变类型
mnn alg och
生物效应
甘露糖生物合成缺陷型 天门冬酰胺侧链糖基化缺陷 外侧糖链添加缺陷型
减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
泛素介导的蛋白质降解作用
靶蛋白
Lys Lys
Ubiquitin 76 aa Ubiquitin ligase E3
靶蛋白
Lys
Ubiquitin ligase E3
酵母菌克隆表达质粒的构建
含有TEL的YAC质粒的构建 • 利用酵母菌的端粒TEL.CEN.ARS等DNA元 件构建人工酵母染色体，可以克隆扩增大 片段的外源DNA，这是构建YAC载体的基 本思路 • YAC载体的装载量的转化程序
Ca2+-ATPase 转录后 转录后 转录后 转录后 转录 羧肽酶Y 转录
抑制超糖基化作用的突变宿主菌
许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖 基团，常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心 和外侧糖链两部分组成。 酵母菌普遍拥有完 整的糖基化系统，但野 生型酿酒酵母对异源蛋 白的糖基化反应很难控 制，呈超糖基化倾向， 因此超糖基化缺陷菌株 非常重要。
提高重组异源蛋白产率的诱变宿主菌
使啤酒酵母中异源蛋白产量提高和质量改善的突变 突变 产生的异源蛋白 增加产量（倍数） 作用位点
SSC1 SSC2 rgrl osel NDS ss1l rho
凝乳酶原 牛生长因子 3-10 凝乳酶原 牛生长因子 鼠α—淀粉酶 5-10 β—内啡肽 7-12 人血清蛋白 溶酶原活化剂抑制因子2型 10 α1 —抗胰蛋白酶P 人溶菌酶 10 人溶菌酶 10 人表皮因子 NDE
酵母菌克隆表达质粒的构建
含有ARS的YRp和YEp质粒及其构建 • ARS为酵母菌中的自主复制序列，大小在 0.8-1.5Kb,染色体上每30-40bp就有一个 ARS元件。 • 由染色体ARS构成的质粒称为Yrp，而由2μ 质粒构建的杂合质粒为Yep。 • 上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高 可达200个，但是经过几代培养后，质粒丢 失率达50%-70%，主要由于分配不均匀所致。
• 酵母着丝粒质粒：来源于酵母染色体的着 丝粒周围的leu2和cdc10之间的一段1.6kb 的序列。带有此着丝粒序列的质粒在酵母 中的行为类似一微型染色体，它可以稳定 遗传，并均匀地分配到子代细胞中，同时 在宿主细胞中的拷贝数很低。 • 但是，含有着丝粒质粒的酵母细胞生长十 分缓慢，而且细胞的生存能力下降。
减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 泛素降解途径衰减的酿酒酵母 UBI4缺陷型： 在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI4基因表达，UBI4-突变 株正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要 低的多，因此UBI4缺陷突变株是外源基因表达理想的受 体。 UBA1缺陷型： UBA1编码泛素激活酶E1，UBA1突变株式致死性的，但 其等位基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导 的蛋白降解。 Ubc4-ubc5双突变型： 七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效。
• 该质粒上共有4个基因：FLP、REP1、 REP2和D．其中FLP基因的编码产物催化 两个IRS序列之间的同源重组，使质粒在A 与B两种形态中转化，REP1、REP2和D基 因均为控制质粒稳定性的反式作用因子编 码基因．上述基因共转录出7种不同分子量 的mRNA分子。
• 2u质粒还含3个顺式作用元件．其中单一的 自主复制子结构(ARS)位于一个IRs的边界 上，REP3(STB)区域是REP1和REP2蛋白 因子的结合位点．对质粒在细胞有丝分裂 时的均匀分配起着重要作用，FRT存在于 两个IRs序列中，大小为50bP，是FLP蛋白 的识别位点。
酵母菌的宿主系统 1. 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌 2. 提高重组异源蛋白产率的诱变宿主菌
3. 抑制超糖基化作用的突变宿主菌
4. 减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌
目前已广泛用于外源基因表达的研究的酵母菌包括：
酵母属 如酿酒酵母 克鲁维酵母属 如乳酸克鲁维酵母 毕赤酵母属 如巴斯德毕赤酵母 裂殖酵母属 如非洲酒裂殖酵母 汉逊酵母属 如多态汉逊酵母 其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究 最详尽，但巴斯德毕赤酵母表达外源基因 最理想
• 整合载体：不含酵母的自主复制序列，因而不
能在酵母中独立复制的一种载体。这种载体必须 在整合到酵母染色体上才能使其上所包含的基因 得到稳定表达。 • 在啤酒酵母中含有30～40个拷贝的可转移的遗传 因子(Ty),其结构包括两个长OFR和两个长末端重 复序列(LTR) , Ty可以整合到宿主细胞的染色体 上。如果在Ty的OFR2的3端与LTR的3端之间插 入外源基因，外源基因就可以随Ty一起整合到酵 母染色体上。
酵母菌的载体系统 载体的一般结构 选择标记 复制子 表达盒 启动子 先导序列 终止子 有用的蛋白结构域 1酵母菌中的野生型质粒 2酵母菌克隆表达质粒的构建
酵母菌种的野生型质粒
酿酒酵母中的2μ环状质粒
几乎所有的酿酒酵母 都含有2μ双链环状质粒， 拷贝数维持50-100个。 Irs反向重复序列600bp， 重组FLP编码产物驱动Irs 的同源重组REP编码产物 控制质粒的稳定性STB REP的结合位点 接合酵母属中的pSRI、 pSR1、pSB2和pSR1以及克 鲁维酵母属中的pKD1质粒 等，均有类似的结构。
• 酵母菌中天然存在的自主复制型质粒并不 多，而且相当一部分野生型质粒是隐蔽型 的，因此目前用于外源基因克隆和表达的 载体质粒都是由野生型质粒和宿主染色体 DNA上的自主复制子结构(ARS)、中心粒 序列(CEN)、端粒序列(TEL)以及用于转化 子筛选鉴定的功能基因构建而成。
• 酵母复制型质粒来源于大肠杆菌质粒pBR322。 同时加入了一段酵母染色体的自主复制序列。 这种质粒一般不会与酵母染色体发生重组， 它转化酵母的转化率很高，但是不能稳定遗 传。
转化质粒在酵母细胞中的命运 用于转化子筛选的标记基因
酵母菌是外源基因最成功的真核生物表达系统 优势在于：
1. 安全无毒，不致病； 2. 有较清楚的遗传背景，容易进行遗传操作； 3. 容易进行载体DNA的导入。DNA转化技术的不断发展优化， 多数酵母菌可以取得较高的转化率； 4. 培养条件简单，容易进行高密度发酵； 5. 能将外源基因表达产物分泌到培养基中； 6. 有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰功能。
缺陷在于：
1. 表达效率相对低 2. 酵母常有密码子偏性，真核基因在其中表达时需要人工 修正。
酵母菌的基因工程
酵母菌作为基因工程受体菌的特征 酵母菌表达外源基因的优势
全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操
作简便 具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统
大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉 能将外源基因表达产物分泌至培养基中 不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全 基因工程受体系统（Generally Recognized As Safe
• 在酿酒酵母中，泛蛋白因子的主要来源是多聚泛 蛋白基因UBI4的表达，UBI4突变株能正常生长， 但其细胞内游离的泛蛋白因子浓度比野生型菌株 低得多，因此这种缺陷株是一个理想的外源基因 表达受体。 • 编码泛蛋白激活酶E1的基因也可作为突变的靶基 因，含有该基因突变的哺乳动物细胞内几乎检测 不出泛蛋白-外源蛋白的共价结合物。酿酒酵母编 码E1蛋白的基因UBA1是一种看家基因，UBA1突 变株是致死性的，但编码UBA1蛋白等位突变株却 可减少泛蛋白因子依赖型异源蛋白的降解作用。 此外，上述6个UBC基因的突变也是构建重组异源 蛋白稳定表达宿主系统的选择方案，
GRAS） 酵母菌是最简单的真核模式生物
酵母基因组特征
与真核生物的基因组相比，啤酒酵母的基 因组很小，仅有16条染色体，含1.4X107 bp, 编码约5000个蛋白质，是目前已知真核生 物中基因组最小的一个。酵母细胞既可以 作为单倍体存在，也可以作为二倍体存在。 这就克服了在其它真核生物中隐性基因控 制的形状难以检测的缺陷。
酵母菌种的野生型质粒
乳酸克鲁维酵母中的线性质粒
乳酸克鲁维酵母中含有两种不同的双链线 性质粒pGKL1和pGKL2，拷贝数为50-100 个，分别携带K1和K2两种能致死宿主细胞的 毒素蛋白基因。
• 酵母菌的载体系统分为三种： 质粒载体 整合载体（integrating vector） 人工染色体 酵母质粒载体又分为： 酵母附加型质粒(yeast episomal plasmid,YEp) 酵母复制型质粒(yeast replicating plasmid,YRp) 酵母着丝粒质粒(yeast centromere plasmid,YEp)