基因工程 第七章 酵母基因表达体系(55P)

酵母菌克隆表达质粒的构建
含有TEL的YAC质粒的构建 • 利用酵母菌的端粒TEL.CEN.ARS等DNA元 件构建人工酵母染色体，可以克隆扩增大 片段的外源DNA，这是构建YAC载体的基 本思路 • YAC载体的装载量可高达800kb，适用于构 建人的基因组文库。
酵母菌的转化系统
酵母菌的转化程序
• 酵母菌中天然存在的自主复制型质粒并不 多，而且相当一部分野生型质粒是隐蔽型 的，因此目前用于外源基因克隆和表达的 载体质粒都是由野生型质粒和宿主染色体 DNA上的自主复制子结构(ARS)、中心粒 序列(CEN)、端粒序列(TEL)以及用于转化 子筛选鉴定的功能基因构建而成。
• 酵母复制型质粒来源于大肠杆菌质粒pBR322。 同时加入了一段酵母染色体的自主复制序列。 这种质粒一般不会与酵母染色体发生重组， 它转化酵母的转化率很高，但是不能稳定遗 传。
酵母菌种的野生型质粒
乳酸克鲁维酵母中的线性质粒
乳酸克鲁维酵母中含有两种不同的双链线 性质粒pGKL1和pGKL2，拷贝数为50-100 个，分别携带K1和K2两种能致死宿主细胞的 毒素蛋白基因。
• 酵母菌的载体系统分为三种： 质粒载体 整合载体（integrating vector） 人工染色体 酵母质粒载体又分为： 酵母附加型质粒(yeast episomal plasmid,YEp) 酵母复制型质粒(yeast replicating plasmid,YRp) 酵母着丝粒质粒(yeast centromere plasmid,YEp)
GRAS） 酵母菌是最简单的真核模式生物
酵母基因组特征
与真核生物的基因组相比，啤酒酵母的基 因组很小，仅有16条染色体，含1.4X107 bp, 编码约5000个蛋白质，是目前已知真核生 物中基因组最小的一个。酵母细胞既可以 作为单倍体存在，也可以作为二倍体存在。 这就克服了在其它真核生物中隐性基因控 制的形状难以检测的缺陷。
酵母菌的宿主系统 1. 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌 2. 提高重组异源蛋白产率的诱变宿主菌
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
3. 抑制超糖基化作用的突变宿主菌
4. 减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌
目前已广泛用于外源基因表达的研究的酵母菌包括：
酵母属 如酿酒酵母 克鲁维酵母属 如乳酸克鲁维酵母 毕赤酵母属 如巴斯德毕赤酵母 裂殖酵母属 如非洲酒裂殖酵母 汉逊酵母属 如多态汉逊酵母 其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究 最详尽，但巴斯德毕赤酵母表达外源基因 最理想
2u质粒
• 几乎所有的酿酒酵母菌株中都存在一个 6318bp大小的野生型2u双链环状质粒，它 在宿主细胞核内的拷贝数可维持在50-100之 间，呈核小体结构，其复制的控制模式与染 色体DNA完全相同。2u质粒上含有两个相 互分开的599bp长反向重复序列(IRs)，两者 在某种条件下可发生同源重组，形成两种不 同的形态(A和B)。
提高重组异源蛋白产率的诱变宿主菌
使啤酒酵母中异源蛋白产量提高和质量改善的突变 突变 产生的异源蛋白 增加产量（倍数） 作用位点
SSC1 SSC2 rgrl osel NDS ss1l rho
凝乳酶原 牛生长因子 3-10 凝乳酶原 牛生长因子 鼠α—淀粉酶 5-10 β—内啡肽 7-12 人血清蛋白 溶酶原活化剂抑制因子2型 10 α1 —抗胰蛋白酶P 人溶菌酶 10 人溶菌酶 10 人表皮因子 NDE
Ca2+-ATPase 转录后 转录后 转录后 转录后 转录 羧肽酶Y 转录
抑制超糖基化作用的突变宿主菌
许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖 基团，常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心 和外侧糖链两部分组成。 酵母菌普遍拥有完 整的糖基化系统，但野 生型酿酒酵母对异源蛋 白的糖基化反应很难控 制，呈超糖基化倾向， 因此超糖基化缺陷菌株 非常重要。
在寄主细胞内极其稳定性主要由两个因素决 定： • 第一，2u质粒在细胞分裂时可将其复制拷 贝均分给母细胞和子细胞. • 第二，当细胞中质粒拷贝数因某些原因减少 时，2u质粒可通过自我扩增自动调节其拷 贝数水平。 • 上述两种复制特性均与FLP蛋白的作用密切 相关，这是2u质粒以有限的复制次数获得 高拷贝的主要机制。
酵母菌是外源基因最成功的真核生物表达系统 优势在于：
1. 安全无毒，不致病； 2. 有较清楚的遗传背景，容易进行遗传操作； 3. 容易进行载体DNA的导入。DNA转化技术的不断发展优化， 多数酵母菌可以取得较高的转化率； 4. 培养条件简单，容易进行高密度发酵； 5. 能将外源基因表达产物分泌到培养基中； 6. 有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰功能。
酵母菌的载体系统 载体的一般结构 选择标记 复制子 表达盒 启动子 先导序列 终止子 有用的蛋白结构域 1酵母菌中的野生型质粒 2酵母菌克隆表达质粒的构建
酵母菌种的野生型质粒
酿酒酵母中的2μ环状质粒
几乎所有的酿酒酵母 都含有2μ双链环状质粒， 拷贝数维持50-100个。 Irs反向重复序列600bp， 重组FLP编码产物驱动Irs 的同源重组REP编码产物 控制质粒的稳定性STB REP的结合位点 接合酵母属中的pSRI、 pSR1、pSB2和pSR1以及克 鲁维酵母属中的pKD1质粒 等，均有类似的结构。
靶蛋白
Lys
蛋白酶体
• 如果外源基因表达产物在酵母菌中具有对泛蛋白依 赖型降解作用的敏感性，则可通过下列方法使这种 降解作用减少到最低程度： • 第一种方法是以分泌的形式表达重组异源蛋白，异 源蛋白在与泛蛋白因子形成共价结合物之前，迅速 被转移到分泌器中，即可有效避免降解作用; • 第二种方法是将外源基因的表达置于一个可诱导的 启动子控制之下，由于异源蛋白质在短期内集中表 达，分子数占绝对优势的表达产物便能逃脱泛蛋白 因子的束缚，从而减少由降解效应带来的损失; • 第三种方法是使用泛蛋白因子生物合成缺陷的突变 株作为外源基因表达的受体细胞;
• 在酿酒酵母中，泛蛋白因子的主要来源是多聚泛 蛋白基因UBI4的表达，UBI4突变株能正常生长， 但其细胞内游离的泛蛋白因子浓度比野生型菌株 低得多，因此这种缺陷株是一个理想的外源基因 表达受体。 • 编码泛蛋白激活酶E1的基因也可作为突变的靶基 因，含有该基因突变的哺乳动物细胞内几乎检测 不出泛蛋白-外源蛋白的共价结合物。酿酒酵母编 码E1蛋白的基因UBA1是一种看家基因，UBA1突 变株是致死性的，但编码UBA1蛋白等位突变株却 可减少泛蛋白因子依赖型异源蛋白的降解作用。 此外，上述6个UBC基因的突变也是构建重组异源 蛋白稳定表达宿主系统的选择方案，
酵母菌克隆表达质粒的构建
含有ARS的YRp和YEp质粒及其构建 • ARS为酵母菌中的自主复制序列，大小在 0.8-1.5Kb,染色体上每30-40bp就有一个 ARS元件。 • 由染色体ARS构成的质粒称为Yrp，而由2μ 质粒构建的杂合质粒为Yep。 • 上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高 可达200个，但是经过几代培养后，质粒丢 失率达50%-70%，主要由于分配不均匀所致。
酵母菌克隆表达质粒的构建
含有酵母菌染色体DNA同源序列的YIp质粒的构建
在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体DNA特定序列 和标记基因， 构建出来的质粒称为Yip。目的基因表达盒通常插 在染色体DNA特定 序列中，这样目的基因就能高效
整合入酵母菌特定的染色体DNA区域。
酵母菌克隆表达质粒的构建
含有CEN的YCp质粒的构建 • CEN为酵母菌染色体DNA上与染色体均匀 分配有关的序列。将CEN插入到ARS质粒 中，获得的新载体称为YCp。 • YCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷 贝数通常只有1-5个。
• 酵母着丝粒质粒：来源于酵母染色体的着 丝粒周围的leu2和cdc10之间的一段1.6kb 的序列。带有此着丝粒序列的质粒在酵母 中的行为类似一微型染色体，它可以稳定 遗传，并均匀地分配到子代细胞中，同时 在宿主细胞中的拷贝数很低。 • 但是，含有着丝粒质粒的酵母细胞生长十 分缓慢，而且细胞的生存能力下降。
减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 泛素降解途径衰减的酿酒酵母 UBI4缺陷型： 在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI4基因表达，UBI4-突变 株正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要 低的多，因此UBI4缺陷突变株是外源基因表达理想的受 体。 UBA1缺陷型： UBA1编码泛素激活酶E1，UBA1突变株式致死性的，但 其等位基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导 的蛋白降解。 Ubc4-ubc5双突变型： 七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效。
转化质粒在酵母细胞中的命运 用于转化子筛选的标记基因
突变类型
mnn alg och
生物效应
甘露糖生物合成缺陷型 天门冬酰胺侧链糖基化缺陷 外侧糖链添加缺陷型
减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
泛素介导的蛋白质降解作用
靶蛋白
Lys Lys
Ubiquitin 76 aa Ubiquitin ligase E3
靶蛋白
Lys
Ubiquitin ligase E3
缺陷在于：
1. 表达效率相对低 2. 酵母常有密码子偏性，真核基因在其中表达时需要人工 修正。
酵母菌的基因工程
酵母菌作为基因工程受体菌的特征 酵母菌表达外源基因的优势
全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操
作简便 具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统
大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉 能将外源基因表达产物分泌至培养基中 不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全 基因工程受体系统（Generally Recognized As Safe
酵母基因表达体系
发展历程
1. 1974年rlarck—walker和Miklos发现在大多数酿 酒酵母中存在质粒。 2. 1978年Hmnen将来自一株酿酒酵母的leu 2基因 导入另一株酿酒酵母，弥补了后者的Leu2缺陷， 标志着酵母表达系统的建立。 3. 1981年Hinnen等用酵母基因表达系统表达了人 干扰素。 4. 我国也在1983年首次用酵母菌表达了乙型肝炎 病毒表面抗原基因。 5. 1996年在全世界科学家的通力合作下，完成了 第一个真核生物——酿酒酵母全基因组的测序。
• 整合载体：不含酵母的自主复制序列，因而不
能在酵母中独立复制的一种载体。这种载体必须 在整合到酵母染色体上才能使其上所包含的基因 得到稳定表达。 • 在啤酒酵母中含有30～40个拷贝的可转移的遗传 因子(Ty),其结构包括两个长OFR和两个长末端重 复序列(LTR) , Ty可以整合到宿主细胞的染色体 上。如果在Ty的OFR2的3端与LTR的3端之间插 入外源基因，外源基因就可以随Ty一起整合到酵 母染色体上。
• 酵母附加型质粒来源于野生型的酵母质粒，这种质粒存 在于很多啤酒酵母株系中，功能不祥。但有一个重要特 点是，该质粒被一段长度约为599bp的反向重复序列分 为两个部分，每一个部分都含有一个启动子和该启动子 控制下的两个基因。其中一个基因为FLP，它编码一个 位点特异性的重组酶，这个酶可以催化反向重复序列之 间的遗传重组。 • 酵母附加型质粒就是在这种质粒的基础上，加入酵母核 DNA序列，以及大肠杆菌pMB9的部分序列组成。故其 既可以在酵母中复制，又可以在大肠杆菌中复制。
• 该质粒上共有4个基因：FLP、REP1、 REP2和D．其中FLP基因的编码产物催化 两个IRS序列之间的同源重组，使质粒在A 与B两种形态中转化，REP1、REP2和D基 因均为控制质粒稳定性的反式作用因子编 码基因．上述基因共转录出7种不同分子量 的mRNA分子。
• 2u质粒还含3个顺式作用元件．其中单一的 自主复制子结构(ARS)位于一个IRs的边界 上，REP3(STB)区域是REP1和REP2蛋白 因子的结合位点．对质粒在细胞有丝分裂 时的均匀分配起着重要作用，FRT存在于 两个IRs序列中，大小为50bP，是FLP蛋白 的识别位点。