实验一 鸡新城疫血凝(HA)和血凝抑制(HI)抗体水平测定法

实验一鸡新城疫血凝（HA）和血凝抑制（HI）抗体水平测定法

1．本次实验的目的和要求

掌握鸡新城疫血凝（HA）和血凝抑制（HI）抗体水平测定法，以便检查疫苗使用效果和制定合理免疫程序。

2．实验内容或原理

某些病毒(如新城疫病毒，禽流感病毒等)能够与动物的红细胞发生凝集，此即为红细胞凝集现象(HA)。这种红细胞凝集现象可于病毒悬液中加入特异免疫血清所抑制，即为红细胞凝集抑制试验(HI)。

3．需用的仪器或试剂等

动物健康成鸡2-5只，被检鸡15-25只。

器材高压灭菌器、滤纸、试管、试管架、离心机、离心管、三棱针、内径2mm聚乙烯塑料管100cm、酒精灯、石蜡、96孔V型微量凝集试验板、0.025mm微量吸液器、微型振荡器、微量移液器、脱脂棉等。

药剂（1）浓缩抗原；（2）生理盐水或磷酸缓冲盐水（PBS）；（3）Alsever细胞保存液；（4）红细胞悬液；（5）待检血清

4．实验步骤

(1)发现与鉴定病毒：鸡新城疫和禽流感病毒分离后，这些病毒能凝集鸡的红细胞，又能被特异性的已知免疫血清抑制其凝集反应，即可鉴定此病毒。

(2)诊断病毒性疾病：如取同一发病的动物早期和恢复期血清进行红细胞凝集抑制实验，如抗体效价有4倍以上升高，即有诊断意义。

（3）免疫机体抗体效价的测定：

3.鸡新城疫（ND）的HA和HI

（1）试验准备

①抗原：一般以鸡新城疫Ⅱ系或LaUra系冻干苗作为已知抗原，进行试验。

② 0.7％细胞悬浮液：由鸡翅静脉或心脏采血，放入含有抗凝剂的灭菌试管(按每毫升血加入3.8％灭菌柠檬酸钠0.2毫升做抗凝剂)内，迅速混匀。如当时不用，可直接采血放入红细胞保存液内(保存液2份，血液1份)于4℃冰箱内可保存两周。

红细胞悬液的配制：将血液注入离心管中，经3000转／分钟，离心5-10分钟，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞加稀释液(生理盐水)洗涤。再用离心机3000转／分钟离心5-10分钟，弃上清，再加稀释液洗涤，如此反复洗涤三次，将最后一次离心后的红细胞泥，按0.7％的稀释度加入稀释液(0.7毫升红细胞泥加99.3毫升稀释液)。

③被检血清：将被检鸡群编号登记，用消毒过的干燥注射器采血，注入洁净干燥试管内(微量法可用孔径2-3毫米塑料管由翅静脉采血)，在室温中静置或离心，待血清析出后使用。

每只鸡应更换一个注射器，严禁交叉使用。

④稀释液：为灭菌的生理盐水。

⑤红细胞保存液的配制方法：葡萄糖2.05克，柠檬酸钠(SHOO)0.80克，柠檬酸(2H20)0.055

克，氯化钠0.42克，蒸馏水加至100毫升。过滤分装，高压灭菌10分钟，放4℃冰箱保存。(2)红细胞凝集试验(HA) 主要是测定病毒的红细胞凝集价，以确定红细胞凝集抑制试验所

用病毒稀释倍数(抗原单位)。

鸡新城疫病毒的HA试验与HI试验现采用微量法，以u或v形微孔塑料板代替试管。

①首先用移液器向每个孔加入稀释液一滴(0.05毫升)。

②用微量移液器取病毒抗原0.05毫升，加入第一孔，反复抽动6次后，吸出0.05毫升加入

第二孔，在第二孔反复抽动6次后，吸出0.05毫升加入第三孔，如此连续稀释至第十一孔

后吸出0.05毫升弃去。第12孔不加病毒液为红细胞空白对照。

判断：沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔

底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。

如上例：病毒液的HA效价以出现完全凝集的抗原最大稀释度为准。HI试验时，病毒

抗原液为0.05毫升内须含4个凝集单位，则应将原病毒液作成64／4=16倍的稀释液。

孔号： 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 滴度：1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:517 1:1024 1:2048 对照

红细胞悬液25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25

作用时间与温度轻轻振荡1-2min 静置30-60min

结果+++ +++ +++ +++ +++ +++ ++﹣﹣﹣﹣﹣注意：+++为完全凝集++为部分凝集—为不凝集

(3)红细胞凝集抑制试验(HI试验)：新城疫病毒凝集红细胞的作用，能被特异性抗体抑制，

因此，可用HI试验(简称血凝抑制试验)测定鸡血清中的HI抗体效价(滴度)，并可用标准血

清，作新分离病毒的鉴定与未知病毒的诊断。

微量法：具体操作如下：

①用移液器向每孔加0.05毫升稀释液，十一孔加0.1毫升。

②用移液器吸取被检血清(或高免卵黄抗体)0.05毫升注入第一孔，抽放6次后，吸出0.05

毫升，注入第二孔，如此连续稀释至第10孔，并从第十孔吸出0.05毫升弃去，血清稀释倍

数依次为1：2～1024，11孔和12孔空白。

③每孔再加入已标定好的四单位病毒液0.05毫升，第十一孔为红细胞对照孔，不加病毒液。

④置振荡器上振荡1-2分钟，放18～22℃静置20分钟。

⑤每孔再加入0.7％红细胞悬浮液0.05毫升，放振荡器上振荡l-2分钟，置18-22℃，30-60分后判定结果。

⑥第十一孔为红细胞对照孔，第十二孔作为抗原对照孔。

结果观察：将反应板倾斜成45℃角，沉于管底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。

能将4单位病毒物质凝集红细胞的作用完全抑制的血清最高稀释倍数，称为该血清的红细胞凝集抑制效价，用被检血清的稀释倍数或以2为底的对数(log2)表示。如上例，该血清的红细胞凝集抑制效价为1：64或HI效价为6(log2)。第十一孔仅含稀释液和红细胞为不凝集对照孔，第十二孔含稀释液，病毒液和红细胞为凝集对照孔。

结果分析如下：

①一般认为鸡的免疫临界水平为1：8(成年)或1：16(雏鸡)，但随地区不同而有差异。

②鸡血清的HI抗体效价高于1：16时可适当推迟新城疫免疫的时间，HI抗体效价在1：16以下，须马上进行新城疫疫苗接种，在新城疫流行的地区或鸡场，鸡的免疫临界水平，应再提高。

③鸡群的HI抗体水平是以抽检样品的HI抗体效价(1og2)的平均值表示的。

如果某鸡群的10份样品中，HI抗体效价为8的有3份样品，为7的有5份样品，为6的有2份样品，它们的平均值为：