5酶类药物的分析检验

3.平衡法:
通过测定酶反应开始至反应达到平衡时产物或底物浓度 总变化量来求出酶活力的方法称为平衡法，或称终点法。因 定时法是在酶反应的动态期进行测定，故需终止反应后才能 测定，而平衡法则无需，因在平衡期中任何一点进行测定， 底物和产物的量都不再变化。 用平衡法测定时，因产物的增加或底物的减少与反应时 间不成线性，故不能把〔p〕或〔s〕 的总变化量除以t来代 表每分钟产物或底物的变化。另外，平衡法也会受到产物抑 制、可逆 反应等因素的影响，由于反应时间较定时法更长， 故这种影响会更大，测定结果也较连续监 测法低，不能代表 初速度，也不是零级反应的速度。但是与定时法相同，只要 待测标本与正常标本在相同条件下反应并测定，亦能以此判 断出待测标本酶活力的相对大小。而且，对于有些零级反应 期很短的酶促反应，用连续监测法和定时法很难测出其初速 度，也只得采用平衡法测定。
产 物 浓
原 因
底物浓度的降低、 底物浓度的降低 、 产物的增加造成的 逆反应的加快 产物的抑制作用 酶本身逐渐失活
度
0
时间
1.定时法:
测定酶反应开始后某一时间内(t1到t2)产物或底物浓 度的总变化量来求取酶反应初速度 的方法称为定时法。因 t1和t2是整个反应历程的两个点，故又称两点法，其中t1一 般 取反应开始的时间，在酶反应进行一定时间(t2)后终止 反应，如加入强酸、 强碱、蛋白沉淀剂等，然后测定底物 或产物的变化。 这种方法的优点是简单，因最后测定产物时酶反应已 被终止，故比色池无需保温装置，显色剂的选择也可不考 虑对酶活力的影响。缺点是如果不用预试验确定，无法了 解酶作用的这段时间内是否都是零级反应，故很难保证测 定结果的真实性。 因此，用定时法测定酶活力时，应先做预试验来确定 线性时间，并在线性时间内进行测定，否则，不能用〔p〕 除以t来表示每分钟产生的〔p〕，并用其计算酶活力单位。
2. 国际单位 :
1961年国际生化学会(IUB)酶学委员会建议 使用统一的国际单位(IU)。规定一 个国际单位 (IU)为在实验规定的条件下(如温度为25℃、最适 pH、最适底物浓度时)，每分钟催化一个微摩尔底 物变化所需要的酶量。酶的浓度可以IU/L或IU/mL 来表示；当底物为蛋白质、多糖等含有多个能被 酶作用的键或基团时，可用催化一个微摩尔被作 用的基团或键的变化来表示酶单位。如采用物理 方法测定，应该在物理量与化学量之间建立对应 关系进行换算 。
(三) 酶活力的表示方法:
酶活力的大小是以酶单位数表示的。 所谓酶单位是在某一特定条件下，使酶 反应达到某一速度所需要的酶量，而速 度即指单ห้องสมุดไป่ตู้时间(秒、分、小时)内反应 物的变化量(毫克、微克、微 摩尔、摩 尔等)。酶单位一般有三种表示方法。
1.惯用单位 :
60年代前，各种酶活力的表示法或酶单 位的定义没有统一的标准，不同酶、 甚至同 一种酶不同的测定法可有不同的定义。
酶活力测定法
酶活力概念
是酶促反应的能力。 酶活力 是酶促反应的能力。酶活力大小就是指在一 定条件所催化的某一化学反应速度的快慢， 定条件所催化的某一化学反应速度的快慢，即酶催化 的反应速度越快，酶活力越高，反之则表示该酶活力 的反应速度越快，酶活力越高， 低。 但是，酶的定量并非对其蛋白质进行定量， 但是，酶的定量并非对其蛋白质进行定量，而是对它 的催化能力进行定量。所以， 的催化能力进行定量。所以，酶的定量就是测定酶的 活力，也即测定酶促反应的速度。 活力，也即测定酶促反应的速度。
【重点掌握】 重点掌握】
2、最适条件下进行酶促水解反应 最适条件下 最适温度 — 37℃ 恒温水浴 37℃ 最适pH pH值 最适pH值 — pH7.5 缓冲溶液 底物浓度足够大 — 1% 酪蛋白溶液1mL 酪蛋白溶液1mL 反应时间准确 — 10min 及时灭活 — 三氯乙酸 2mL
【重点掌握】 重点掌握】
用连续监测法测定的缺点是因酶和底物边保 温边测定的需要，仪器(比色计或分光光度计)必 须有保温装置，而且产物(或底物)应是可被直接 测定的化合物，且借以测定的特殊性质，必须与 底物(或产物)有明显差别，否则，需加入其它试 剂(如显色剂、酶试剂等)，将其转变成可测物质， 但必须专虑到加入的酶试剂或显色剂对待测酶是 否有影响。
酶习惯上或测定时使用的反应速度的单位 酶习惯上或测定时使用的 反应速度的单位 定 反应速度的单位定 义为酶的活力单位。 义为酶的活力单位 。 有的甚至直接用测得的物理 量，如单位时间内消光值的变化 (∆A/t) 表示酶活力 单位。 单位。 这种单位简单方便，省去了许多计算； 这种单位简单方便，省去了许多计算；但只能 进行酶活力的相对比较。 进行酶活力的相对比较。
常见的测定方法有分光光度法、荧光法、化学反应法等。 常见的测定方法有分光光度法、荧光法、化学反应法等。
计算酶活力。 计算酶活力。
实验
枯草芽孢杆菌 蛋白酶活力的测定
【目的要求】 目的要求】
学习Folin学习Folin-酚法测定蛋白酶活力的原理方法 Folin 掌握分光光度计的操作方法
【重点掌握】 重点掌握】
酶活力的测定： 一. 酶活力的测定：
（一）酶活力测定的基本知识：
酶不易制成纯品，其中含有很多杂质，真正的含酶量并 不多。所以酶制剂中酶的含量都用酶活力来表示。 酶活力是通过测定酶促反应过程中单位时间内底物的减 少量或产物的生成量，即测定酶促反应的速率来获得的。一 般情况下，产物和底物的改变量是一致的，但测定产物的生 成要比测定底物的减少为好，这是由于反应体系中使用的底 物往往是过量的，而反应时间通常又很短，尤其是在酶活力 很低时，底物减少量仅占加入量的很小比例，因此测定不易 准确；反之，产物从无到有(如不纯的酶制剂中内源性产物不 计的话)，只要测定方法灵敏，准确度可以很高，故酶活力测 定绝大多数是采用测定产物生成速率的方法。
国际单位的应用有利于比较同一样品中不同酶的活力。 但也有不少缺点，如 ：①从惯用单位换算成国际单位比较麻 烦；②某些酶作用于Mr不明的大分子底物(如淀粉酶、胃蛋白 酶等)，采用底物减少法来定量时，无法计算其底物减少的微 摩尔数；③ 同一种酶用不同的方法测定，换算成国际单位时， 其结果仍不相同。欧美各国由于地理条件及实验室内温度的 不同，常采用不同的测定温度，如25℃、30℃、37℃等，这 也导致即使用国际单位表示酶活力，其正常参考范围也是不 同的。
指每毫克酶蛋白所含的酶活力单位数
比活力 ＝
酶活力单位数（U 酶活力单位数（U） 酶蛋白质量（mg） 酶蛋白质量（mg）
比活力是酶制剂纯度的常用指标 —— 比活力越大，表示酶越纯 比活力越大，
酶的纯度
纯化倍数 = 每次比活力/第一次比活力 每次比活力/ 产率(回收率) 每次总活力/第一次总活力×100% 产率(回收率) = 每次总活力/第一次总活力×100%
3.时间对照 若酶制剂不纯(含有产物)和底 物自发分解的情况并存，则必须做一个酶和底物 都加入但反应时间为零的对照，也即先用蛋白沉 淀剂或其它试剂停止反应，再加入底物。 在双底物反应时，对照管可以加入酶制剂和 两种底物中的一种，因缺乏另一种底物，不可能 生成产物，至于应加入两种底物中的哪一种可以 根据预实验决定。 测定管中的产物量必须减去对照管中的产物 才是真正由酶促反应所生成的产物量。
3.katal单位 3.katal单位
1972年酶学委员会又提出一种新的酶单位katal(简称 kat)，即在确定的最适反应条件下每秒钟催化一摩尔底物变 化所需要的酶量为1kat单位。 60× 1kat = 60×106 IU 1nkat = 0.06IU 1IU = 16.67nkat
酶的比活力
蛋白酶浸提、分离、 蛋白酶浸提、分离、提取技术 最适条件下酶促水解反应的操作程序 酶活力的测定及活力单位的计算
【重点掌握】 重点掌握】
测定酶活的程序 1、将酶液稀释到一定程度 2、最适条件下进行酶促水解反应 最适条件下 3、测定反应量 4、根据酶活单位定义计算酶活力
【重点掌握】 重点掌握】
1、将酶液稀释到一定程度 在底物浓度一定，反应时间一定内维持初速度， 底物浓度一定，反应时间一定内维持初速度， 必须调整酶的最适稀释倍数即吸光度限制在 必须调整酶的最适稀释倍数即吸光度限制在 0.25～0.40范围内。 0.25～0.40范围内。 范围内
以产物浓度对反应时间作图， 以产物浓度对反应时间作图，可得到酶促反 应速度曲线
产 物 浓 度
注意：初速度的 注意： 测定是关键， 测定是关键，为 什么？ 什么？
0
时间
可见，反应速度只在最初一段时间内保持恒定， 可见，反应速度只在最初一段时间内保持恒定， 随着时间的延长，反应速度逐渐下降 随着时间的延长，
酶活力测定的步骤
配制底物、对照品溶液、供试品酶溶液等 。 配制底物、对照品溶液、 确定酶催化反应的温度、 、浓度、 确定酶催化反应的温度、pH、浓度、辅助因 子等反应条件。 子等反应条件。 进行酶促反应，准确记录反应时间。 进行酶促反应，准确记录反应时间。 终点法（终止反应）、连续法测定产物的增量。 ）、连续法测定产物的增量 终点法（终止反应）、连续法测定产物的增量。
（二）酶活力测定的方法：
酶活力测定要符合两个原则： ①在零级反应期测定，即-〔s〕或〔p〕与 反应时间t成正比， ②反应速度与酶量成线性关系，即 〔E〕= k(-〔s〕/ t) = k〔p〕/ t k(k〔 常用的方法有： 1.定时法 2.连续检测法 3.平衡法
如何测定酶活力？ 如何测定酶活力？
测定酶活力时通常都附有适当的对照(control ) 以消除非酶促反应所生成的产物，常用的对照有以 下几种，可根据具体情况予以选择。 1.样品对照 若测定酶活力的样品是粗提取液， 属于非常不纯的酶制剂，往往含有所欲测定的产物， 也可能在保温时由于内源性底物的旁反应产生相同 的产物，这些可通过不加底物单加样品的样品对照 予以消除。 2.底物对照 某些酶的底物能自发(非酶促)地 分解成所欲测定的产物，可以通过不加样品单加底 物的底物对照予以消除。
3、测定反应量 测定产物的增加量或底物的减少量 — 测定酪氨酸的生成量 4、根据酶活单位定义计算酶活力 酶活单位定义：在上述条件下，1min水解酪蛋 酶活单位定义：在上述条件下，1min水解酪蛋 白产生1μg酪氨酸的酶量为一个酶活力单位。 白产生1μg酪氨酸的酶量为一个酶活力单位。 1μg酪氨酸的酶量为一个酶活力单位
2.连续监测法:
连续测定(每15s-1min监测一次)酶反应过程中某一反 应产物或底物的浓度随时间的变化来求出酶反应初速度的 方法称为连续监测法，又称动力学法或速率法。定时法只 测定两个时间 点，而连续监测法则进行多点连续测定。 这种方法的优点是可将多点的测定结果(〔s〕或〔p〕 的变化)连接成线，容易找到成直线的区段，可以观察到是 否偏离零级反应，因而可选择线性反应期来计算酶活力， 不需要终止反应。也可在反应曲线的拐点处求出其切线的 斜率，即初速度。连续监测法测定的结果通常较定时法高， 也较为准确，因为前者测定时间较短，而在酶反应的初始 阶段底物最充裕，而产物的抑制作用、可逆反应、酶的变 性作用等均很小。
酶活力测定的方法
有两种主要方法即终止反应法和连续反应法。 终止反应法：是在恒温反应系统中，每隔一定时间， 终止反应法 取出一定体积的反应液，用强酸强碱或SDS以及加热 等使反应立即停止，然后用化学法放射性化学法或酶 偶联法分析产物的形成量或底物的消耗量。这是最经 典的酶活力测定方法，几乎所有的酶都可以根据这一 原理设计出具体的测定方法。 连续反应法：无须终止反应，而是在酶反应过程中用 光化学仪器或电化学仪器等来监测反应的进行情况， 对记录结果进行分析，然后计算出酶活力。
示例：从某细胞中提取的一种蛋白水解酶的粗提液300mL 示例：从某细胞中提取的一种蛋白水解酶的粗提液300mL 含有150mg蛋白质，总活力为360单位。 含有150mg蛋白质，总活力为360单位。经过一系列纯化 150mg蛋白质 360单位 以后得到的4mL酶制品(含有0.08mg蛋白) 总活力为288 以后得到的4mL酶制品(含有0.08mg蛋白)，总活力为288 4mL酶制品 0.08mg蛋白 单位。请问回收率是多少？纯化了多少倍？ 单位。请问回收率是多少？纯化了多少倍？