分子诊断的先河——Southern印迹杂交技术 ppt

分子诊断的先河——Southern印迹杂交技术

摘要：

上世纪70年代美籍华裔科学家简悦威采用Southern印迹杂交技术成功诊断了α地中海贫血症和镰状细胞贫血症，开创了临床分子生物学检验的先河，他是怎样做到的呢？

知识点：

分子杂交、核酸分子杂交、探针

Southern印迹杂交、琼脂糖凝胶电泳技术、印迹技术

临床分子生物学检验技术的发展第一阶段：分子杂交

第二阶段：PCR

第三阶段：生物芯片

第四阶段：DNA测序

美籍华裔科学家简悦威应用DNA分子杂交技术诊断α地中海贫血(1976)、镰状细胞贫血(1978)

分子杂交(molecular hybridization) 两条单链核酸、抗原与抗体、受体与配体等经相互作用重新组成新的杂交分子

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核酸分子杂交

两条序列互补的单链核酸之间(DNA 与DNA ，DNA与RNA或RNA与RNA)借助氢键相连形成杂合双链

碱基互补配对

A=T,A=U,C≡G

杂合双链

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核酸分子杂交：待测核酸与探针

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核酸探针 (nucleic acid probe)

能与待测靶核酸特异互补杂交的已知被标记的核酸分子

核酸探针的标记

1.放射性核素标记：32P、3H、35S等

2.非放射性标记：生物素、地高辛、

荧光素等

分子杂交(molecular hybridization)

反应介质液相杂交

固相杂交

原位杂交

印迹杂交

Southern印迹杂交(E.M.Southern,1975) ——镰状细胞贫血症的分子诊断(1978)

琼脂糖凝胶电泳技术Southern

印迹杂交印迹技术

分子杂交技术

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琼脂糖凝胶电泳技术——分离、纯化、鉴定核酸 碱性缓冲液 琼脂糖凝胶 负极 正极

核酸加样孔 电极

琼脂糖凝胶电泳技术

可将分子量和构象不同

的核酸分子进行分离

小分子量核酸电泳结束后不同分子量的核酸的迁移位置

琼脂糖凝胶电泳技术图谱DNA Marker 核酸样品

琼脂糖凝胶电泳技术Southern

印迹杂交印迹技术

分子杂交技术

印迹技术 (Blotting）

将核酸分子通过一定方式转移并固定到固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上

印迹技术膜

核酸

凝胶

琼脂糖凝胶电泳技术Southern

印迹杂交印迹技术

分子杂交技术

视频源于网络非原创应用Southern印迹检测红色特异DNA片段

1. 从样品中提取DNA

并通过限制性核酸内切酶消化样品DNA

2.消化后的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳技术分离

3. 凝胶中DNA经碱处理变性成单链，

4. 单链DNA经印迹技术从凝胶转移到膜上并固定

5. 附着DNA的膜经预杂交后与标记探针进行杂交

6. 通过洗涤除去未杂交的探针，

经放射性自显影检测与探针序列互补的特定DNA片段

Southern 印迹技术

1. 通过限制性核酸内切酶消化样品DNA，

2. 消化后的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳技术分离，

3. 凝胶上被分离好的DNA片段经碱处理变性成单链，

4. 单链DNA经印迹技术从凝胶转移到膜上并固定，

5. 附着DNA的膜经预杂交后与标记探针进行杂交，

6. 杂交后洗脱未特异结合的探针，经放射性自显影检测与探针序列互补的特定DNA片段

制备待测核酸样品

分离、变性、转移、固化DNA 片段

杂交

检测杂交信号

预杂交

制备携带标记的核酸探针

漂洗去除未参与杂交的标记探针

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应用Southern印迹杂交技术诊断镰状细胞贫血？

分子诊断的先河——Southern印迹杂交技术