植物叶绿素的定量测定

植物叶绿素的定量测定

一，植物叶绿素定量测定的意义

叶绿素是植物进行光合作用的主要色素，是一类含脂的色素家族，位于类囊体膜。叶绿素吸收大部分的红光和紫光，但反射绿光，所以叶绿素呈现绿色，它在光合作用的光吸收中起核心作用。叶绿素为镁卟啉化合物，包括叶绿素a、b、c、d、f以及原叶绿素和细菌叶绿素等。叶绿素不很稳定，光、酸、碱、氧、氧化剂等都会使其分解。酸性条件下，叶绿素分子很容易失去卟啉环中的镁成为去镁叶绿素。叶绿素有造血、提供维生素、解毒、抗病等多种用途。定量叶绿素的测定可以了解植物物质转化的程度和速度。

二，植物叶绿素定量测定原理

根据叶绿体色素提取液对可见光光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其消光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。

根据朗伯-比尔定律，某有色溶液的消光度D与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即：

D=klc

（k为比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为 1cm时，k为该物质的比吸收系数。各种有色物质溶液在不同波长下的比吸收系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的消光度而求得。）

如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总消光度等于各组分在相应波长下的总和，这就是消光度的加和性。今欲测定叶绿素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素在该波长下的比吸收系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时为了排除类胡罗卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。已知叶绿素a、b的80%丙酮提取液（注：丙酮有毒，可用下文阐述的酒精代替。）在红光区的最大吸收峰分别是663nm 和645nm，又知在波长663nm下，叶绿素a、b在该溶液中的比吸收系数分别是82.04和9.27，在波长645nm下分别16.75和45.6，可根据加和性原则列出以下关系式：

D663=82.04C a+9.27C b

D645=16.75 C a +45.60 C b

(上式中D663、D645表示叶绿素溶液在波长663nm和645nm时的消光度；C a、C b叶绿素a、b浓度（mg/L）)

由上两式组成方程组解得：

C a=12.72 D663-2.59 D645

C b=22.88D645-4.67D663

将C a、C b相加即得叶绿素总量C T

C T= C a+ C b=20.29 D645+8.05 D663

另外，由于叶绿素a、b在652nm的吸收峰相交，两者有相同的比吸光系数（均为34.5），也可以在此波长下测定一次消光度（D652）而求出叶绿素a、b总量：

C T=（D532×1000）/34.5

在叶绿素存在的条件下，用分光光度计法可同时测定出溶液中的类胡罗卜素的含量。

Lichtenthaler等对Arnon法进行了修正，提出了80%的丙酮提取液中3中色素含量的计算公式：

C a=12.21D663-2.81 D646

C b=20.13D646-5.03D663

C x·c=（1000D470-3.27C a-104C b）/229

(式中C a、C b叶绿素a、b浓度mg/L；C x·c类胡萝卜素的总浓度；D663、D646和D470表示叶绿素溶液在波长663nm、646nm和470nm下的消光度)

由于叶绿素在不同溶剂中的吸光光谱有差异，因此，在使用其他溶剂提取色素时，计算公式也有所不同。叶绿素a、b在96%的乙醇中的最大吸收峰的波长分别是665nm和649nm，类胡罗卜素为470nm（95%乙醇：纯丙酮=1:1（v/v）的混合提取液中的最大吸收峰波长为663nm、646nm和470nm），可据此列出以下关系式：

C a=13.95D663-6.88 D646

C b=24.96D646-7.32D663

C x·c=（1000D470-2.05C a-114.8C b）/245

该公式应是96%乙醇提取液的计算公式

三，仪器与用具

722分光光度计（或紫外分光光度计可直接程序测试三个值）；剪刀；25ml棕色容量瓶；小漏斗；7cm直径定量滤纸；吸水纸；擦镜纸（可用卫生纸代替）；滴管；电子天平（精确到0.01g）；称量纸。

四，试剂

提取液：

1.96%乙醇（或80%的丙酮，下同）（用纯净水与纯酒精或丙酮配制）（供方法1）

2.95%乙醇：纯丙酮=1:1（v/v）（供方法2，混合提取液效果好一些，但是丙酮有毒）

注：以上两种提取液均可提取叶绿素，各自优缺点如上所述，但二者比色时的波长不同。

五，方法与步骤

1，取鲜叶（或从冰箱里拿出来的叶子）去掉叶脉，截取叶片中段，擦净组织表面污物，并吸干叶片表面附着水。（注意：因为叶绿素遇光易分解，所以取下的叶子及整个流

程都应该采取避光处理），准确称取0.2g鲜样3份分别置于3个50ml带刻度的离心管中。（按Lichtenthaler等（1983）修正的Arnon法（1949）进行叶绿素（Chl）和类胡萝卜素（Car）含量测定。）

2，吸取10ml提取液置于离心管中，密封并置于30～40℃温箱中（尽量按照条件做，实在达不到的延长提取时间至72小时），此过程中需轻摇几次。当叶片完全变白时即可比色。

3，比色时，以提取液为空白，在波长663nm、646nm和470nm下测定吸光度；每样重复测定2次。

附，1，分光光度计的使用方法

1.1接通电源，打开仪器开关，掀开样品室暗箱盖（必须地啊！），预热30分

钟。

1.2将灵敏度开关调至“1”档（若零点调节器调不到“0”时，需选用较高档。）

1.3根据所需波长转动波长选择钮，选择需要的波长值。

1.4调零调百。将空白液分别倒入比色皿3/4处，用擦镜纸（或高级卫生纸）擦

清外壁，放入样品室内，使空白管对准光路，调零调百——在暗箱盖开启状

态下调节零点调节器，使读数盘指针指向t=0处，.盖上暗箱盖，调节“100”调

节器，使空白管的t=100，指针稳定后测量样品液。

1.5测量完后，关闭机器，样品室用软布或软纸擦净，注意仪器保养。

注意：1. 定量分析的时候要注意样品线性的浓度范围，如果浓度太高或者太低都会影响到数据的准确度。2.对光敏感的样品液，如酶类，测量时要注意迅速有效。

六，结果计算

1，提取液为酒精时的计算方法：