植物组织培养 第4章 植物组织培养中常见问题及解决办法

第三节 试管植物的玻璃化现象及其防治措施
玻璃化现象：常发生在继代培养
当植物材料不断地进行离体繁殖时，有些培养物的 嫩茎、叶片往往会呈半透明水渍状的现象。
玻璃化试管苗的生理失调症：
茎、叶表面无蜡质，体内的极性化合物水平较高， 细胞持水力差，植株蒸腾作用强，无法进行正常移栽。
原因：
不同种类、品种间，试管苗的玻璃化程度也有所差 异；湿度大；光照强度过低；培养基细胞分裂素水平较 高。
玻璃化
具体解决的方法为：
1、培养基成分：增加培养基中的溶质水平，
以降低培养基的水势；减少培养基中含氮化合 物的用量； 2、培养条件：增加光照；增加容器通风，最 好进行CO2施肥，这对减轻试管苗玻璃化的现 象有明显的作用；降低培养温度，进行变温培 养，有助于减轻试管苗玻璃化的现象发生 3、生长调节剂：降低培养基中细胞分裂素 含量，可以考虑加入适量脱落酸。 -
③使用抗氧化剂 在培养基中，使用半胱氨酸、抗坏血酸、
PVP（聚乙烯吡咯烷酮）等抗氧化剂能够较为有效地避免或 减轻很多外植体的褐变现象。
④使用吸附剂活性炭 0.1%-0.5%的活性炭对防止褐变也有
较为明显的效果。
⑤连续转移 对容易褐变的材料可间隔12~24h的培养后，再
转移到新的培养基上，这样经过连续处理7-l0d后，褐变现象 便会得到控制或大为减轻。
消毒：花雷或幼穗的表面消毒用70%酒精
－－－次氯酸钠10－20分钟或0.1%升汞7 －10分钟。操作熟练仅用70%酒精表面消 毒后即取花药接种
接种： 培养：
2、花药培养时花粉发育途径
离体条件下，改变了花粉原来的生活环境，花 粉的正常发育途径受到抑制
有四种发育方式：
（1）营养细胞发育途径（A型） 花粉经第一次有丝分裂形成不均等营养核和生 殖核，生殖核一般不分裂或分裂几次就退化， 营养核经多次分裂而形成多细胞团，并迅速增 殖而突破花粉壁，细胞持久分裂形成类胚体或 愈伤组织，最后形成单倍体植株
3、发生方式 ：以茎尖、茎段等发生不定芽的方式繁 殖不易发生变异或变异率极低。甘肃农业大学通过节 培法繁殖名贵葡萄品种，经5年—8年继代培养，其变 异频率与常规方法相同，在数成株中仅发现一株变异 此外用菊花茎尖、腋芽培养，变异较低，而从花瓣诱 导的变异较高。由花椰菜根诱导的不定芽和再生植株 中有不少变异，而从顶端分生组织（花菜）产生的 4000个再生植株基本没有变异。通过愈伤组织和悬浮 培养分化不定芽的方式获得再生植株变异率较高。通 过分化胚状途径再生植株变异较少，通过茎尖或分生 组织培养增殖侧芽可以保持基因型基本不变。在高浓 度的激素作用下，细胞分裂和生长加快，不正常分裂 频率增高，再生植株变异也增多。
（二）提高遗传稳定性，减少 变异的措施
在进行植物快速微繁时，应尽量采用不易发生体细 胞变异的增殖途径，以减少或避免植物个体或细胞发 生变异，如采用生长点、腋芽生枝、胚状体繁殖方式， 可有效地减少变异缩短继代时间，限制继代次数，每 隔一定继代次数后，从新开始接外植体进行新的继代 培养；取幼年的外植体材料；采用适当的生长调节物 质种类和较低的浓度；减少或不使用培养基中容易引 起诱变的化学物质；定期检测、及时剔除生理、形态 异常苗，并进行多年跟踪检测，调查再生植株开花结 实特性，以确定其生物学性状和经济性状是否稳定。
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补充内容：
花药培养
1、花药培养的一般操作
材料选取：单核中、晚期花粉为宜
一般在接种前预先用醋酸洋红、I－KI溶液等染 色压片镜检，确定花粉发育的时期。 （烟草：花雷和花冠大约与萼片等长 禾谷类作物：孕穗期，剥出的花药呈淡绿色。
材料预处理：低温、高温、生长素及其它
方法处理－－提高愈伤组织和苗分化频率 低温预处理按作物不同而不同
思考题
1. 概念：褐变、玻璃化现象 2. 何为褐变现象？起因？解决方法？ 3. 何为玻璃化现象？起因？解决方法？
二、褐变的主要原因
①植物品种间的差异
②生理状态
基因
成年＞幼龄
③培养基成分
④培养条件不当
高无机盐、细胞分裂素
强光照、高温度、培养时间 过长
三、减轻褐变现象发生的方法
①选择合适的外植体 最好选择生长处于旺盛的外植体，这
样可以使褐变现象明显减轻。
②合适的培养条件 降低无机盐成分、植物生长物质水平和
温度，暗培养，低温过度等；
（2）生殖细胞发育途径 营养核退化，生殖核经多次分裂发育成 多细胞团，进而通过愈伤组织或胚状体 形成单倍体植株 （3）营养细胞和生殖细胞同时发育 此途经结果形成2N，3N或4N （4）花粉均等分裂 均等分裂成二个均等的子核－－产生 壁形成二个子细胞－－发育成多细胞团 －－愈伤组织或胚状体
3、花药培养的方法 1）琼脂固体培养法 0.5%－0.7% 呈半固体状
第四节 其他问题及对策
遗传稳定性问题
遗传稳定性问题，即保持原有良种特性问题。虽然 植物组织培养中可获得大量形态、生理特性不变的 植株，但通过愈伤组织或悬浮培养诱导的苗木，经 常会出现一些体细胞变异个体，虽然其中有些是有 益变异但更多的是不良变异诸如观赏植物不开花、 花小或花色不正；果树植物不结果、抗性下降或果 小、产量低、品质差等问题，在生产上造成很大损 失，并容易引起经济纠绘，如香蕉试管苗中的不良 变异表现植株矮小、不结果，给果农造成损失。
第四章 植物组织培养中常见问 题及解决办法 本章教学目的、要求 ：
理解并掌握植物组培易发问题、其产 生的原因及调控方法，并能够采取有效 措施解决污染、褐变和玻璃化等常见问 题 教学重点、难点： 植物组培易发问题产生的原因及调控 方法
主要内容：
第一节 污染原因和防治措施 第二节 外植体的褐变及其防治 第三节 试管植物的玻璃化现象及其 防治措施 第四节 其他问题及对策
体细胞无性系变异的频率相当高，且不能逆转，有的高达40%—60%，如非 洲堇的个别品种、玉簪等，有的高达100%，如马铃薯、菠萝等。
（一） 影响遗传稳定性的因素
1、基因型 基因型不同，发生变异的频率也不同。 在玉簪中，杂色叶培养的变异频率为43%，而且绿色 叶仅为1.2%。甘蔗品系H37-1933和H50-7209中得到 的再生植株分别有12.1%和34.8%变异香龙血树愈伤组 织培养再生植株全部发生变异嵌合体植株通过组培， 其嵌合性更大。单倍体和多倍体变异大于二倍体。 2、继代次数 根据报道，试管苗的继代培养次数和时 间影响植物稳定性，是造成变异的关键因素。一般随 继代次数和时间的增加，变异频率不断提高。
在正常发育的植物组织中,底物、氧气、多酚
氧化酶(PPO)同时存在并不发生褐变，是因为在正
常的组织细胞内由于多酚类物质分布在细胞的液泡
内，而PPO则分布在各种质体或细胞质中，这种区
域性分布使底物与PPO不能接触。而当细胞膜的结 构发生变化和破坏时，则为酶创造了与PPO接触的 条件，在氧存在的情况下使酚类物质氧化成醌，进 行一系列的脱水、聚合反应，最后形成黑褐色物质， 从而引起褐变。
第二节 外植体的褐变及其防治
发生的时间：初代培养外植体
一、原理：
目前认为植物组织培养中的褐变主要是由酶促褐变引起的，培养 材料变褐主要是由伤口处分泌的酚类化合物引起的。酶促褐变如 同一般的酶促反应，其发生必须具备三个条件，即酶、底物和氧。
酚类很不稳定，在溢出过程中与多酚氧化酶接触，在 多酚氧化酶的催化下，迅速氧化成褐色的醌类物质和 水，醌类物质又会在酪氨酸酶等的作用下，与外植体 组织中的蛋白质发生聚合，进一步引起其他酶系统失 活。从而导致组织代谢活动紊乱，生长停滞，最终衰 老死亡。此外，由于组织的老化病变也会使多酚氧化 酶激活而引起褐变。