不同乳制品(酸奶)中活性乳酸菌的分离及鉴定

《微生物学综合实验》实验报告2012.10

一．实验目的

1.从乳制品中分离纯化活性乳酸菌

2.利用革兰氏染色等手段对分得菌株进行形态学鉴定

3.通过16S rDNA序列测定及分析，鉴定分得菌株的种属

4.利用Sequence Scanner V1.0软件及MEGA4软件构建待鉴定菌株的发育树，并进行序列同源性分析；

5.学习并掌握普通光学显微镜油镜的使用技术及微生物形态观察；

6.学习微生物制片、染色的基本技术，掌握乳酸菌的简单染色法及无菌操作接种技术；

7.通过对培养基的配制，了解配制培养基的一般步骤和方法，掌握微生物实验常用的器皿的清洗与包扎、培养基的制备、消毒灭菌

8.了解各种灭菌的基本原理和应用范围，以及实验室中常用的灭菌方法。了解酸奶中乳酸菌分离原理,观察乳酸菌的基本形态,掌握用显微镜测微尺测量微生物细胞大小、数目的测定的方法

9.了解稀释平板计数的原理，熟练掌握混合平板培养法。明确显微镜计数的原理并学习使用血球计数板进行微生物计数的方法

10.初步学会乳酸菌培养的基本技术，了解并掌握细菌鉴定中常用生理生化反应的原理和方法，掌握进行微生物大分子水解试验的原理和方法

11.了解并掌握微生物菌种保藏的常用方法及其优缺点，并了解不同微生物对不同的生物大分子的分解利用情况，认识微生物代谢类型的多样性

二．实验原理

1.菌株分离纯化

平板划线法是指把杂菌样品通过在平板表面划线稀释而获得单菌落的方法。一般是将混杂在一起的不同种微生物或同种微生物群体中的不同细胞，通过在分区的平板表面上作多次划线稀释，形成较多的独立分布的单个细胞，经培养而形成多个相互独立的单菌落。通常认为这种单菌落便为某种微生物的“纯种”。

MRS培养基是经特殊设计，专门用于乳酸菌培养、富集、分离纯化的培养基。本实验采用划线分离法，在MRS培养基上划线稀释不同品牌的酸奶原液，以期分得乳酸菌纯种。

2.革兰氏染色

革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤。通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细菌细胞壁内形成不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇脱色处理时，因失水而使网孔缩

小，再加上其细胞壁不含类脂成分，乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色。而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂时，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后，菌体细胞壁呈无色，再经番红等红色染料复染，便能使革兰氏阴性菌呈红色。

3.16S rDNA序列分析及发育树构建

细菌16S rDNA序列分析鉴定是一种常用的微生物鉴定方法。rRNA是研究细菌进化和亲缘关系的重要指标，它含量大(约占细菌RNA总量的80%)，并存在于所有细菌中。rRNA基因由保守区和可变区组成，在细菌中高度保守，素有“细菌化石”之称，是细菌系统分类学研究中最有用和最常用的分子钟。原核生物的rRNA分为3种，分别为5S rRNA、16S rRNA和23S rRNA，并且它们位于同一操纵子上。rRNA的基因在大多数原核生物中都具有多个拷贝，拷贝数目从1到14不等。其中，16S rDNA序列分析已成为细菌种属鉴定和分类的标准方法，大约2500个种的16S rDNA全序列已经被报道。根据它们的序列同源性，已经构建了各种属的系统发育树。

16S rDNA的扩增需要微生物染色体DNA作为模板。首先提取微生物的染色体DNA，以此为模板，加入通用引物进行扩增，对扩增出来的片段提交至NCBI-BLAST 网站进行序列比对并构建发育树，最终得知该微生物的种属归类。

三．实验材料

1.样品来源：

本次实验样品购于学校超市销售的光明畅优原味酸奶、蒙牛冠益乳椰果口味酸奶以及养乐多乳酸菌饮品。

2.MRS培养基（成分见表1）：

表1MRS培养基成分

MnSO4.H2O0.025%

吐温801mL/L培养基

CaCO30.375%

琼脂 1.5%

备注：1.K2HPO4、MgSO4.7H2O、MnSO4.H2O分开配制，混匀后合并，避免产生沉淀；

2.配制完成后，用NaOH和HCl调培养基pH至6.2~6.4；

3.CaCO3在培养基pH调至恰当值后加入。

3.对照菌株

金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）。

注：以金黄色葡萄球菌为阳性对照，革兰氏染色结果为阳性（紫色）；以大肠杆菌为阴性对照，革兰氏染色结果为阴性（红色）。

4.生化试剂：

革兰氏染色：结晶紫、碘液、95%乙醇、番红

镜检：香柏油

PCR：2×Taq mix、ddH2O、16S rDNA序列上下游通用引物

16S rDNA序列上下游通用引物：

上游：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’

下游：5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’

琼脂糖凝胶电泳：溴化乙锭（EB）、琼脂糖

5.仪器设备：

5.1设备

恒温水浴槽、台式高速离心机、振荡器、PCR仪、水平电泳仪、凝胶成像系统、基因测序仪、台式光学显微镜、电子天平、恒温培养箱、烘箱、超净工作台、高温蒸汽灭菌锅。

5.2实验用品

锥形瓶、无菌培养皿、药勺、无菌玻璃棒、无菌吸管、接种环、移液枪（2.5μL、20μL、200μL、1000μL）、无菌EP管、无菌PCR管、无菌试管、载玻片。

四．实验内容

1.乳酸菌的分离与纯化

1.1培养基配制

据实验材料章节所列成分配制MRS培养基500ml，调pH至6.2~6.4，高温蒸汽灭菌（灭菌条件：121℃，30min），而后分装至9个无菌培养皿（制成固体培养基）及6