卡介菌多糖核酸体外抗病毒活性试验

中国农业大学学报 ２ （ ） ： ０ １ １， １ ６ ３ １ ３ ３ １ ３ ９ Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆＣ ｈ ｉ ｎ ａＡ ｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ａ ｌＵ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｇ ｙ
卡介菌多糖核酸体外抗病毒活性试验
乔飞鸿 吕英军 张晓裕 王晓斌 鲍恩东
（ ，犖 ，犖 ） 犆 狅 犾 犾 犲 犲狅 犳犞 犲 狋 犲 狉 犻 狀 犪 狉 犲 犱 犻 犮 犻 狀 犲 犪 狀 犻 狀 狉 犻 犮 狌 犾 狋 狌 狉 犪 犾犝 狀 犻 狏 犲 狉 狊 犻 狋 犪 狀 犻 狀 １ ０ ０ ９ ５，犆 犺 犻 狀 犪 犵 狔犕 犼 犵犃 犵 狔 犼 犵２
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１ ３ ４
中 国 农 业 大 学 学 报
２ ０ １ １年 第１ ６卷
噬细胞的吞 噬 与 消 化 活 力 ， 并 激 活 Ｔ 细 胞， 使之释 放多种活性因 子
［ ］ ５ห้องสมุดไป่ตู้
； 它还可增强机体内自然杀伤细
［ ６ ７］
种于 ９ ／孔 ， 置３ ６ 孔 细 胞 培 养 板， １ ０ ０μ Ｌ ７ ℃、 ５％ 培 养 箱 中 培 养 。 细 胞 长 满 单 层 后 ， 弃 去 培 养 Ｃ Ｏ ２ 液， 用Ｈ ’ ａ ｎ ｋ ｓ液洗涤 ２ 次 。 将 Ｂ Ｃ Ｇ Ｐ Ｓ Ｎ 用 含 ２％ 体积分数 小 牛 血 清 的 Ｒ ＰＭ ＩＭ ｅ ｄ ｉ ｕ ｍ１ ６ ４ ０稀释成 １ ０ ０、 ２ ０ ０、 ４ ０ ０、 ６ ２ ５、 ８ ０ ０、 １０ ０ ０、 １２ ５ ０、 １６ ０ ０、 ２５ ０ ０和 ／ 然后将１ ３２ ０ ０μ ｍ Ｌ 共１ ０个 质 量 浓 度 梯 度， ０个 ｇ 梯度的药物分别加 入 已 长 成 单 层 的 细 胞 板 中 ， 每孔 每个 质 量 浓 度 重 复 ４ 孔 ， 并设正常细胞对 １ ０ ０μ Ｌ， 每孔加 照 。 置 ５％ Ｃ Ｏ ７ ℃培养４ ８ｈ 后 ， ２ 培养箱 ３ 入２ ／ 。继续 ０μ Ｌ 以维持液配 制 的 ＭＴ Ｔ（ ５ｍ ｍ Ｌ） ｇ 培养４ｈ 后中止 。 弃孔内液体 ， 每孔中分别加入１ ５ ０ ， 轻轻震摇１ ， 使 Ｌ 二甲基亚砜 （ ＤＭ Ｓ Ｏ） ０～１ ５ｍ ｉ ｎ μ 甲瓒充分溶解 。 用酶 标 仪 测 定 其 在 ５ ７ ０ｎ ｍ 波长处 的吸收值 （ ； 以下列公式计算细胞活性 ： Ｏ Ｄ ５ ７ ０ｎ ｍ） 细胞活性／％＝ 测定孔的平均吸收值 ０ ０ 正常对照孔平均吸收值 ×１
［ １］
２］ 葡萄糖 ［ 。Ｂ 成仅为 Ｄ Ｃ Ｇ Ｐ Ｓ Ｎ 中哪种组分起主要 ３］ 作用至今尚不明确 。 王慧等 ［ 自２ ０ 世纪 ７ ０ 年代进
行了卡介 苗 有 效 成 分 的 研 究 ， 并形成了 Ｂ Ｃ Ｇ Ｐ Ｓ Ｎ 的现行生产工艺 ， 在保留了卡介苗免疫作用的同时 ， 降低了使已感染结核菌的致敏机体产生 Ⅳ 型变态反
（ 南京农业大学 动物医学院 ， 南京 ２ ） １ ０ ０ ９ ５
摘 要 为探讨卡介菌多糖核酸 （ 的抗病毒效果 ， 对离体培养的鸡胚成纤维 （ 细胞进行水疱口炎病 Ｂ Ｃ Ｇ Ｐ Ｓ Ｎ） Ｃ Ｅ Ｆ） 毒（ 感染 ， 用四甲基偶氮唑盐 （ 比色法 检 测 Ｂ 用细胞病变法（ 检 Ｖ Ｓ Ｖ） ＭＴ Ｔ） Ｃ Ｇ Ｐ Ｓ Ｎ对Ｃ Ｅ Ｆ 细胞活性的影响； Ｃ Ｐ Ｅ） 并在安全浓度范围内筛选 Ｂ 测Ｂ Ｃ Ｇ Ｐ Ｓ Ｎ对Ｖ Ｓ Ｖ 的抑制作用 ， Ｃ Ｇ Ｐ Ｓ Ｎ 抑制 Ｖ Ｓ Ｖ 的最佳作用时间和作用剂量 。 试 验结果表明 ： 但抑制作用并非随着其剂量的增加和 作 用 时 间 的 Ｂ Ｃ Ｇ Ｐ Ｓ Ｎ 能显著抑制 Ｖ Ｓ Ｖ在Ｃ Ｅ Ｆ 细胞上的生长 ， 质量浓度为 １ ／ 产生的抗病毒活 性 最 强 ； 当Ｂ 延长而增强 ， ４ ４． ０μ ｍ Ｌ的 Ｂ Ｃ Ｇ Ｐ Ｓ Ｎ在Ｃ Ｅ Ｆ 细胞上作用 ２ ４ｈ 后 ， Ｃ Ｇ ｇ ／ Ｐ Ｓ Ｎ 质量浓度大于 ８ ０ ０μ ｍ Ｌ 时则对 Ｃ Ｅ Ｆ 细胞具有明显的毒性作用 。Ｂ Ｃ Ｇ Ｐ Ｓ Ｎ 可诱导 Ｃ Ｅ Ｆ 细 胞 产 生Ｉ Ｆ Ｎ α和 ｇ ， 研究结果显示 ： Ｉ Ｆ Ｎ Ｂ Ｃ Ｇ Ｐ Ｓ Ｎ 的抗病毒作用与其诱导的干扰素有关 。 β 关键词 卡介菌多糖核酸 ； 鸡胚成纤维细胞 ； 水疱口炎病毒 ； 抗病毒 中图分类号 Ｓ８ （ ） ５ ９． ７ 文章编号 １ ０ ０ ７ ４ ３ ３ ３ ２ ０ １ １ ０ ３ ０ １ ３ ３ ０ ７ 文献标志码 Ａ
胞（ 活 力、 白细胞介素 ＮＫ 细胞 ） ２和白细胞介素 ２ 受体表达 ， 诱导 干 扰 素 形 成 产生 大 量 的 Ｉ Ｇ 抗体 ｇ
［ ］ ８
； 亦可持续刺激机体
。 因 此， Ｂ Ｃ Ｇ Ｐ Ｓ Ｎ 具有提
高机体的细胞和体 液 免 疫 功 能 ， 从而增强机体抗感 抗 过 敏、 抗 肿 瘤 细 胞 生 长 等 抗 病 能 力。 目 前 染、 Ｂ Ｃ Ｇ Ｐ Ｓ Ｎ 在人类医学临床中应用于预防和治疗哮 慢性支气管炎 、 结核 、 过敏性鼻炎 、 皮肤过敏性疾 喘、
ｏ ｌ ｓ ａ ｃ ｃ ｈ ａ ｒ ｉ ｄ ｅｎ ｕ ｃ ｌ ｅ ｉ ｃ ａ ｃ ｉ ｄｏ ｆ 卡介菌多糖核酸 （ ｐ ｙ 又称卡介苗 犅 犪 犮 犻 犾 犾 狌 狊犆 犪 犾 犿 犲 狋 狋 犲犌 狌 犲 狉 犻 狀， Ｂ Ｃ Ｇ Ｐ Ｓ Ｎ） 素， 是卡介苗经热酚法提取多糖和核酸 ， 配以灭菌生 理盐 水 制 成 的 具 有 免 疫 调 节 作 用 的 生 物 活 性 物 。Ｂ 另外含 Ｃ Ｇ Ｐ Ｓ Ｎ 的主要成分为多糖和核酸 ， 有极少量的蛋白 ； 多糖相对分子质量大 ， 具有一定的 免疫原性 ， 经分离 纯 化 后 ， 得 到 均 一 组 分， 其单糖组 质
４］ 应等不良反应 ［ 。
巨 噬 细 胞 增 生， 增强巨 Ｂ Ｃ Ｇ Ｐ Ｓ Ｎ 可刺 激 单 核
收稿日期 ：２ ０ １ ０ ０ ７ ２ ２ 基金项目 ： 国家 “ ” 计划项目资助 （ ） ；教育部博士点基金项目 （ 博导类 ） （ ） ８ ６ ３ ２ ０ ０ ８ ＡＡ １ ０ Ｚ ３ ２ ８ ２ ０ １ ０ ０ ０ ９ ７ １ １ ０ ０ ０ ７ 第一作者 ： 乔飞鸿 ， 硕士研究生 ， ： Ｅ ｍ ａ ｉ ｌ ｉ ａ ｏ ｆ ｅ ｉ ｈ ｏ ｎ ． ｃ ｏ ｍ ＠ｑ ｑ ｇ ｑ 通讯作者 ： 鲍恩东 ， 教授 ， 博士生导师 ， 主要从事动物免疫病理及分子病理研究 ， ： ＿ Ｅ ｍ ａ ｉ ｌ ｂ ｅ ｎ ｄ ｏ ｎ ａ ｕ ． ｅ ｄ ｕ ． ｃ ｎ ＠ｎ ｇ ｊ
Ｓ ｔ ｕ ｄ ｎａ ｎ ｔ ｉ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓａ ｃ ｔ ｉ ｖ ｉ ｔ ｉ ｎ ｄ ｕ ｃ ｅ ｄｂ Ｃ Ｇ Ｐ Ｓ Ｎｉ ｎｃ ｈ ｉ ｃ ｋｅ ｍ ｂ ｒ ｏ ｙｏ ｙ ｙＢ ｙ 犻 狀狏 犻 狋 狉 狅 ｆ ｉ ｂ ｒ ｏ ｂ ｌ ａ ｓ ｔ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ
，Ｌ ，Ｚ ， ＷＡ ，Ｂ Ｑ Ｉ Ａ ＯＦ ｅ ｉ ｈ ｏ ｎ ＵＹ ｉ ｎ ｕ ｎ Ｈ Ａ Ｎ ＧＸ ｉ ａ ｏ ｕ Ｎ ＧＸ ｉ ａ ｏ ｂ ｉ ｎ Ａ ＯＥ ｎ ｄ ｏ ｎ ｇ ｇ ｊ ｙ ｇ
１ 材料与方法
１． １ 试验材料 Ｂ Ｃ Ｇ Ｐ Ｓ Ｎ 由南京农 业 大 学 动 物 医 学 院 病 理 实 验室自行提取和保存 （ 硫酸 苯酚法 测定其 中 多糖 的 质量分数为 ７ 紫外分光光度 法 测 定 其 所 含 核 ５． ８％ ； ； 酸的质量分数 为 １ ８． ２ ２％ ） Ｒ ＰＭ ＩＭ ｅ ｄ ｉ ｕ ｍ１ ６ ４ ０培 胰蛋白酶为美国 养基 为 美 国 Ｇ ｉ ｂ ｃ ｏ 公 司 产 品； Ｉ ｎ ｖ ｉ ｔ ｒ ｏ ｅ ｎ 公司 产品 ； １ ０日龄 Ｓ Ｐ Ｆ 种蛋购 自乾 元 浩 ｇ 优级新生牛血清 生物股份有限公司 南 京 生 物 药 厂 ； 购自中美合资兰州 民 海 生 物 工 程 有 限 公 司 ； 鸡胚成 的制备 ： 用细胞生长 液调 整 Ｃ 纤维细胞 （ Ｃ Ｅ Ｆ） Ｅ Ｆ细
８ １ ４］ 病、 白癫风和肿瘤等多 种 疾 病 ［ 。然 而， 由于国内
外尚未有可 供 兽 用 的 Ｂ Ｃ Ｇ Ｐ Ｓ Ｎ， Ｂ Ｃ Ｇ Ｐ Ｓ Ｎ 在畜牧 养殖业中应用的 相 关 报 道 甚 少 。 为 此 ， 本试验拟通 过Ｂ 鸡胚成纤 Ｃ Ｇ Ｐ Ｓ Ｎ 对感染水疱口炎病毒 （ Ｖ Ｓ Ｖ） 旨在探讨 Ｂ 维细 胞 的 病 毒 抑 制 作 用 ， Ｃ Ｇ Ｐ Ｓ Ｎ对 为兽医临 床应用 提供 理 论 Ｖ Ｓ Ｖ 的体外抗病毒效果 ， 和试验依据 。