初始污染菌检测分解

3. 将管口在火焰上通过两三次，但勿烧烫。再迅速将 挑取有菌的接种环伸进斜面内，从斜面的底部向上 划一条接种线，又自下而上蜿蜒接种成曲线。
4. 退出接种环，塞上管塞。接种环经火焰灭菌后放置。 5. 培养后，沿接种线长出菌苔，非接种线的部位应无
细菌生长。
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无菌技术
•分离技术 •划线分离法
•酵母菌个体形态
酵母菌是单细胞真核微生物。酵母菌细胞的形态通常有球形、卵 圆形、腊肠形、椭圆形、柠檬形或藕节形等。比细菌的单细胞个体要 大得多，一般为1~5微米′5~30微米。酵母菌无鞭毛，不能游动。 酵母菌具有典型的真核细胞结构,有细胞壁、细胞膜、细胞核、细胞 质、液泡、线粒体等，有的还具有微体。
组段间接种环的灭菌、冷却！
分段划线法
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无菌技术
•金黄色葡萄球菌的保藏
增菌性培养
选择性培养基分离 菌种。
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一般为冻干粉剂，安瓿 瓶密封包装。
选择性培养基分离菌种。
斜面接种、培养 低温保藏
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无菌技术
•无菌器材
实验器材 灭菌器材 消毒器材
凡是检验中使用的器材，能灭菌处 理的，必须灭菌处理。如：玻璃器 皿、吸管、培养基、稀释剂、无菌 衣、口罩等，在使用前必须经过适 当方法灭菌，并在较洁净的环境中 保存备用。
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酵母菌形态特征
大多数酵母菌的菌落特征与细菌相似，但比细菌菌落大而厚， 菌落表面光滑、湿润、粘稠，容易挑起，菌落质地均匀，正反面和 边缘、中央部位的颜色都很均一，菌落多为乳白色，少数为红色， 个别为黑色。
啤酒酵母的菌落
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微生物群体生长规律
•规律的描述
将少量单细胞纯培养接种到一恒定容积的新鲜液体培养基 中，在适宜的条件下培养，定时取样测定其细菌含量，可以看 到以下现象：开始有一短暂时间，细菌数量并不增加，随之细 菌数目增加很快，既而细菌数又趋稳定，最后逐渐下降。如果 以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速度为纵坐标 作图，可以得到一条曲线，称为繁殖曲线，通常又称为生长曲 线。生长曲线代表了细菌在新的适宜的环境中生长繁殖直至衰 老死亡全过程的动态变化。根据细菌生长繁殖速率的不同，可 将生长曲线大致分为延迟期、对数期、稳定期和衰亡期四个阶 段。
生物污染；避免操作者自身被微生物感染。
• 无菌操作在有洁净级别的实验室中进行，与试验相 关的金属器械、玻璃器皿、稀释剂等应经过灭菌处 理；其他的材料应经过表面消毒、紫外线照射消毒 后，再带入实验室 。
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无菌技术
• 实验室安全制度 1.安全通则
2.生物安全 •微生物检验质量控制制度
1.技术培训和考核制度 2.仪器和试剂的校对制度 3.实验记录制度 4.结果质疑和核对制度 5.技术方法的规范制度
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细菌形态特征
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细菌形态特征
粘质沙雷氏菌的菌落特征
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细菌形态特征
铜绿假单孢菌的菌落特征
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细菌形态特征
金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适 生长温度37°C，最适生长pH 7.4。 平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径1-2mm。血平板菌落周围形成透明的溶血 环。
有 有
脂多糖（LPS）,包括脂蛋白 A，核心多糖和特异性多糖 三个部分。LPS对动物具有 毒性作用，它牢固地结合在
细胞表面，只在菌体融解时
才释放，称为细菌内毒素。 其中脂蛋白A是内毒素的主 要生物学活性组分。
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真菌形态特征
• 霉菌个体形态
霉菌亦称丝状真菌，是在分类学上很不相同的许多真菌的一部 分，凡是生长在营养基质上形成绒毛状、蜘蛛网状或絮状菌丝体 的真菌，统称为霉菌，霉菌为真核微生物，其结构比细菌复杂。
• 微生物与微生物学
自然界中存在着一个数量极其庞大、个体微小和结构 简单的生物类群，即微生物。微生物大多数为单细胞， 必须借助光学显微镜放大千倍或电子显微镜放大数万倍 才能肉眼可见的一类微小生物的统称。
微生物学是研究微生物的形态结构、分类、生理代谢、 遗传变异、生态分布和微生物与人类、动植物关系等的 一门学科。我们对微生物深入研究的目的在于更好地开 发微生物资源，充分利用微生物有利于人类生活方面。 控制微生物的有害方面，使之更好地为人类服务。
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无菌技术
•检验过程的控制
1、在所有操作中均不应大幅度或快速动作，以免搅动空气中尘 埃微粒。
2、使用玻璃器皿应轻取轻放，避免破损，以防培养物扩散。 3、在近火焰区操作。 4、使用金属接种器具、用前、用后均需燃烧灭菌。 5、应用橡胶乳头套在吸管上端，吸吹供试液或培养液等，切勿
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无 菌 技术
•菌 种 •菌种保藏原理
保藏的原则是根据微生物的菌种生理、生化特性，在人工创造的条件 下尽量降低微生物细胞的代谢强度，使细胞基本上处于休眠状态，生长繁 殖受到抑制但又不至于死亡，以降低菌种的变异率。
•菌种保藏步骤
选择典型菌落
确定菌体形态
•菌种保藏方法
方法
主要原理
琼脂斜面低温保藏 法
都适用。
（2）缺点：保藏期短；传代次数多，易变异和污染。
•注意事项
（1）保藏菌种的选择。 （2）定期检查。 （3）做好记录。
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无菌技术
•半固体石蜡保存法 •方法
用石蜡让培养物与空气隔绝，以降低菌种的生理生化水
平，并可防止水分蒸发，从而延长菌种的保藏时间。
•适用范
围
本法适用与部分霉菌、酵母菌和放线菌等，对细菌的效
•无菌环境
无菌环境是指人们用物理的或化学的方法，在某一可控的 空间内使微生物数量降低到最低限度，接近于无菌的一种空 间。
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试验环境的要求及无菌操作
• 环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的 单向流空气区域内进行。
• 阳性实验室、检查间分离。 • 严格按无菌操作,防止实验室的培养物被其他外来微
有去污作用，然后用流水彻底冲洗，可有效除去手上大多数暂 住菌，如连续洗2～3次(视手的污染程度)，使残余的微生物减 少到最低水平，再用消毒液洗手，如洗必泰、苯扎溴铵、碘 伏、乙醇、过氧乙酸等。 5、操作人员将手部消毒后，再穿戴无菌工作服(包括鞋、帽、口罩 等)。严格的无菌服应是戴帽套头的无扣的上衣，颈部、脸部及 袖口是紧口的，以保护身体，防止污染。一般的无菌衣是背开 口，围胸部、紧扣颈部与长袖紧口的，以保护身体，防止污染。 6、在进入无菌室后，进一步用浸有消毒液的棉球或泡沫塑料物消 毒手，然后可进行检验或实验操作。
•细菌菌落形态
单个或少数细菌细胞生长繁殖后，会形成以母细胞为中心的 一堆肉眼可见、有一定形态构造的子细胞集团，这就是菌落。细 菌菌落常表现为湿润、粘稠、光滑、较透明、易挑取、质地均匀 以及菌落正反面或边缘与中央部位颜色一致等。细菌的菌落特征 因种而异。 可作为鉴定细菌种的依据。 菌落图
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主要方面：（1）实验前的准备 （2）实验中的操作 （3）意外事故的处理
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无菌技术
•进入无菌室的控制
1、定期检查无菌环境的空气是否符合规定； 2、无菌室在使用前开启紫外线灯30~60min进行空气消毒； 3、在进行接种倾注琼脂平板均需在无菌室超净工作台或接种罩内操作 3、检查一切进入无菌环境的器材灭菌、消毒的标志物是否完备； 4、洗手消毒：首先用肥皂涂在手上揉搓10～15s，肥皂虽不杀菌，
• 细菌菌落的常规描述
1. 大小：直径 2. 形状：圆形、假根形、不规则型 3. 隆起形状：扩展、苔状、低凸、凸面、乳头状 4. 边缘：整齐、波状、裂叶状、圆锯齿状、有缘毛 5. 表面状态：光滑、皱褶、颗粒状、龟裂状、同心环状 6. 表面光泽：闪光、不闪光、金属光泽 7. 质地：油脂状、膜状、脆 8. 透明程度：不透明、半透明
衰亡期：稳定期后如再继续培养 细菌死亡率逐渐增加，以 致死亡数大大超过新生数，群 体中活菌数目急剧下降，出现 了“负生长”，此阶段叫衰亡期
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稳定期：又称恒定期或最高生长期。处于稳定期 的微生物，新增殖的细胞数与老细胞的 死亡数几乎相等，整个培养物中二者处 于动态平衡，此时生长速度又逐渐趋向 零。
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微生物的分类
微生物
非细胞型 微生物
原核细胞型 微生物
病毒
细菌
真核细胞型 微生物
真菌
亚病毒因子
放线菌
衣原体 支原体等
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原生生物
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细菌形态特征
• 细菌个体形态
细菌是一类细胞细而短（细胞直径约0.5μm,0.5-5μm）、结 构简单、细胞壁坚韧以二等分裂方式繁殖和水生性较强的原核微生 物，分布广泛。 形态图
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细菌形态特征
金黄色葡萄球菌的单个菌落在Baird-Parker琼脂平板上呈圆形,表面光滑、 凸起、湿 润,直径2～3mm。灰黑色至黑色,有光泽,常有浅色(非白色)的边 缘,周围绕以不透明圈 (沉淀),其外常有一清晰带。当用接种针触及菌落时 具有黄油样粘稠感。
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细菌形态特征描述
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霉菌形态特征
由于霉菌的菌丝较粗而长，因而霉菌的菌落较大，有的霉菌的菌丝 蔓延，没有局限性，其菌落可扩展到整个培养皿，有的种则有一定的局 限性，直径1~2厘米或更小。菌落质地一般比放线菌疏松，外观干燥，不 透明，呈现或紧或松的蛛网状、绒毛状或棉絮状；菌落与培养基的连接 紧密，不易挑取；菌落正反面的颜色和边缘与中心的颜色常不一致。
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微生物操作技术－无菌环境是前提！
无菌技术概念
主要是指在微生物实验工作中，控制或防止各类微生物的 污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施，其中包括无菌环 境设施、无菌实验器材等，统称为无菌技术。 无菌环境的 应 用是一个完整的操作技术体系。若其中的任何一个环节污染， 那么其他环节虽是无菌操作，也将完全失去意义。
果较差。
•特点
（1）优点：简便，易推广。
•注意事项
（1）液体石蜡的高度。 （2）定期检查。 （3）做好记录。
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无菌技术
•斜面培养基接种技术 •方法
1. 左手持分离培养的平板培养基，右手持接种环，经 火焰烧灼，冷却后在平板上挑取菌落。
2. 左手立即放下平板，换持斜面培养基，用右手小指 和无名指拔出管塞，夹持于手指之间。
一次性使用医疗用品 初始污染菌检测
江苏省医疗器械检验所 一次性器具室
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微生物基础知识
• 微生物基础知识 • 无菌技术 • 初始污染菌检测关键步骤 • 致病菌检查
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2
Biblioteka Baidu
微生物学检查
无菌检查
微生物限度检查 其他（初始污染菌）
细菌、真菌数量
控制菌
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微生物基础知识
液体石蜡保藏法 干燥（砂土）保藏
法
冷冻真空干燥法
液氮超低温保藏法
低温（4℃） 低温，缺氧
干燥，无营养
干燥，缺氧、低 温
超低温
选择保藏方法
适用的微生 物 广泛 广泛
产孢微生物
广泛 广泛
包藏时间
1～6个月 1年以上 1～10年 5 ～10年 数十年
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定期检查
特点 简便 简便 简便有效 复杂但有效 复杂但有效
凡检验用器材无法灭菌处理的，使 用前必须经消毒处理。如：无菌室 的桌凳、天平、工作台以及工作人 员的手等。
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无菌技术
•无菌操作
基本概念：无菌操作一般是指在无菌环境条件下，使用无菌制品或无 菌器材进行检验或实验的过程中， 能防止微生物污染与干 扰的一种常规操作方法。
操作目的：（1）保证检验物品不被环境中的微生物的污染； （2）防止被检微生物在操作中污染实验人员和实验环境。
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细菌形态特征
• 细菌基本结构
核质
核 蛋白
荚膜
细胞壁
胞浆膜
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细菌形态特征
• 革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的细胞壁结构比较
细胞壁结构
G＋
G－
厚度 强度 糖类含量 脂类含量 磷壁酸 脂多糖
20－80nm 坚韧
约45％ 约2％
无 无
10－15nm 疏松
约15％ 约20％
•规律示意图
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微生物群体生长规律
延迟期：少量细菌接种到新鲜培养基后，一般不 立即进行 繁殖，生长速度近于零。处于延迟期 细菌细胞的特点是分裂迟缓、代谢活跃。
对数期：对数期又称指数期。这一阶段突 出特点是细菌数以几何级数增加， 代时稳定，细菌数目的增加与原生 质总量的增加，与菌液混浊度的增 加均呈正相关性。
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无菌技术
•琼脂斜面低温保存法
•方法 将经常使用的菌种的典型菌落接种在斜面上，按规定的温度和时间培
养，待充分生长后，把培养好的新鲜菌种管用牛皮纸包好，4度冰箱保藏。 每隔1个月移种一次，继续进行保藏。
•适用范
围
本法适用与经常使用的细菌、酵母菌等。
•特点 （1）优点：简便，易推广；一般不需要另选则保藏用培养基；对大多数